目的:构建最优的基于2A多肽策略的抗CD19嵌合抗原受体表达载体,为后期的B细胞恶性肿瘤临床治疗研究提供基础。方法:通过分子克隆技术构建pGIZ-EF1α-19CAR和4-1BBL表达载体,然后连接到pGIZ-EF1α-19CAR-P2A-4-1BBL表达载体中。将构建的重组质粒与两种包装质粒(psPAX.2和PMD2.G)共转染293T细胞以制备所需的慢病毒;MACS珠粒分选技术在分选健康人外周血T细胞时,利用antiCD2-antiCD3-antiCD28单克隆抗体磁珠加IL-2体外扩增培养T细胞;浓缩后的慢病毒感染T细胞,建立CAR-T细胞,利用流式细胞术检测19CAR和4-1BBL的共表达;通过细胞杀伤实验等手段检测CAR-T特异性杀伤细胞的功能。结果:①通过琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定构建的pGIPZ-19CAR-P2A-4-1BBL慢病毒表达载体构建成功。②19CAR-P2A-4-1BBL慢病毒转染293T细胞,制得CAR-T细胞,并利用流式细胞仪检测阳性细胞百分率,测定CAR的表达,流式结果表明CD19-CAR-构建成功,可以在细胞膜表面表达。③制备的病毒溶液感染T细胞。通过19CAR-IRES-4-1BBL和19CAR-P2A-4-1BBL感染T细胞后杀伤能力比较。两者均随效靶比的递增,细胞杀伤力变大,当CAR-T细胞与靶细胞比例达到40∶1时,细胞裂解率达到90%左右。两者CAR-T细胞的细胞杀伤能力差异无统计学意义(P>0.05)。结论:本课题成功构建了基于2A肽策略的慢病毒表达载体,通过转染获得所需病毒颗粒,慢病毒颗粒感染磁珠分选的T细胞获得抗CD19 CAR-T细胞,初步构建了治疗B淋巴细胞白血病的CAR-T技术平台。