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【摘要】目的观察蜈蚣提取物（ECP）与顺铂（DDP）联合运用对人肺癌A549在体外及活体环境下的影响。方法体外环境下人肺癌A549细胞培养；活体采用裸鼠皮下移植瘤进行试验。分别观察单用ECP或DDP以及两者联用对A549细胞的作用。结果DDP联用ECP与ECP联用DDP，对A549细胞的抑制作用比单用ECP或DDP时分别增效1.80倍和2.60倍，两药的合并指数为0.93。DDP联用ECP对抑制移植瘤的体积变化与单用DDP比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论蜈蚣提取物与顺铂联用在体外及活体环境下均有协同作用；两者联用的作用优于单用。
【关键词】蜈蚣提取物；顺铂；肺癌；移植瘤
顺铂和蜈蚣[1]是肺癌常用的中药和西药。二者结合使用是否可以达到较好抗肿瘤作用了。我课题组对此进行了研究。
1材料和方法
1.1材料及仪器少棘蜈蚣、顺铂购于本院，人肺癌A549细胞株购于湘雅医学院。高糖DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜、MTT、分析纯。纯系雄性裸小鼠本校SPF级动物实验室饲养。
1.2蜈蚣提取物制备[2]蜈蚣生药制成超微粉，采用液氮快速冻融联合丙酮沉淀法制备提取物备用。
1.3细胞培养A549细胞培养于高糖DMEM培养液中，置于培养箱中培养，2-3d更换1次，常规传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。
1.4移植瘤的制备与观察制备移植瘤模型：浓度107/ml的A549肺癌细胞用1ml注射器于裸小鼠背部皮肤皮下注射0.2ml。术后分为4组。分别为DDP组（3mg/kg）、DDP+30mg/kgECP组、DDP+60mg/kgECP组和对照组（生理盐水）。第15d开始进行药物干预，腹腔注射0.4ml/次/天，连续21d，第36d处死动物。在用药后第0d、7d、14d、21d测量肿瘤的最长径（A）和最宽径（B），根据公式[5]V=A×B2/2计算肿瘤体积。
1.5肺癌A549细胞体外的实验与观察
1.5.1MTT法测定ECP及DDP的毒性作用细胞接种于96孔板内，培养24h。根据预实验结果设置药物干预浓度，设置5个层次的DDP及ECP浓度，对照组加入培养液及同剂量的生理盐水。继续培养48h后，弃药液，加入MTT液和培养液，培养箱内孵育4h，用PBS液清洗两次，弃MTT液，加入二甲基亚砜，旋涡振荡器振荡10min充分溶解结晶。LOGIT法计算作用A549细胞48h后蜈蚣提取物对肺癌A549细胞的IC50值及IC10值。
1.5.2ECP联合DDP对体外A549细胞的作用按上述方法常规培养24h，分为两组，一组为不同浓度的ECP加入IC10浓度的DDP，一组为不同浓度的DDP加入IC10浓度的ECP。MTT法检测ECP及DDP的IC50值，合并指数（CI）根据公式计算[4]：CI=联合用药时A药IC50/A药单用时IC50+联合用药时B药IC50/B药单用时IC50。CI>1.05时具有拮抗作用；CI<0.95时表示两种药物具有协同作用；0.96 1.6统计学处理计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，采用SPSS16.0统计软件，组间比较采用t检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1裸鼠移植瘤体积的比较DDP+30mg/kgECP组裸鼠移植瘤给药后第0d、7d、14d、21d体积分别为98.7±9.1、123.7±8.9、154.5±9.1、193.8±13.5；DDP+60mg/kgECP组分别为103.5±12.4、114.7±9.6、138.8±12.1、169.3±11.4；DDP组分别为100.2±10.6、156.0±11.2、191.5±13.3、249.0±20.8；对照组分别为101.7±8.6、220.0±24.6、286.5±31.1、352.5±56.4。DDP组与DDP+ECP组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2ECP及DDP对人肺癌A549细胞的作用MTT结果显示，ECP及DDP均以剂量依赖的方式抑制人肺癌A549细胞，ECP的IC50值为1989.61μg/mL，IC10值为195.89μg/mL；DDP的IC50值为24.05μg/mL，IC10值为2.20μg/mL。DDP联用IC10浓度的ECP的IC50值为9.26μg/mL；ECP联用IC10浓度的DDP的IC50值为1100.43μg/mL，分别增效1.80倍和2.60倍，CI为0.93，CI<0.95，两种药物联用有协同作用。
3讨论
众多实验研究表明，蜈蚣提取物有多种作用[3]，课题采用人肺癌A549的细胞株作为本次实验的受试细胞。本研究体外实验表明，DDP与ECP联用具有协同作用。动物体内试验研究也显示DDP联合ECP可以抑制移植瘤生长速度。蜈蚣中存在抗癌活性的组分[4]；蜈蚣多种提取物有抗肿瘤的作用：蜈蚣多糖可Hela细胞阻滞于G2/M期，并诱导凋亡[5]。但研究只局限于整体水平，其具体有效成份仍不清楚，这也是今后需要继续努力研究的方向之一。
总之，本研究表明在体外及活体环境下蜈蚣提取物与顺铂联合运用对人肺癌A549有较明显的抑制作用，其联合用药的效果优于单用蜈蚣提取物或单用顺铂。
参考文献
[1]朱国民.蜈蚣在肿瘤方面的作用及研究进展[J].中国医师杂志，2008，10（6）：859-861.
[2]许亚军，林俊兵.蛋白提纯研究进展[J].天津化工，2006，20（4）：9-11.
[3]陈红琳，李小莉，甘明.墨江蜈蚣的药理作用[J].湖北中医杂志，2012，25（l）：501.
[4]曾红，张国刚，程巨龙.蜈蚣中抗癌活性成分的提取[J].湖南中医杂志，2004，5（20）：57-58.
[5]李兴暖，韩雅莉，余卫国.蜈蚣多糖对Hela细胞的增殖抑制作用研究[J].时珍国医国药，2009，20（7）：1571-1573.
【关键词】蜈蚣提取物；顺铂；肺癌；移植瘤
顺铂和蜈蚣[1]是肺癌常用的中药和西药。二者结合使用是否可以达到较好抗肿瘤作用了。我课题组对此进行了研究。
1材料和方法
1.1材料及仪器少棘蜈蚣、顺铂购于本院，人肺癌A549细胞株购于湘雅医学院。高糖DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜、MTT、分析纯。纯系雄性裸小鼠本校SPF级动物实验室饲养。
1.2蜈蚣提取物制备[2]蜈蚣生药制成超微粉，采用液氮快速冻融联合丙酮沉淀法制备提取物备用。
1.3细胞培养A549细胞培养于高糖DMEM培养液中，置于培养箱中培养，2-3d更换1次，常规传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。
1.4移植瘤的制备与观察制备移植瘤模型：浓度107/ml的A549肺癌细胞用1ml注射器于裸小鼠背部皮肤皮下注射0.2ml。术后分为4组。分别为DDP组（3mg/kg）、DDP+30mg/kgECP组、DDP+60mg/kgECP组和对照组（生理盐水）。第15d开始进行药物干预，腹腔注射0.4ml/次/天，连续21d，第36d处死动物。在用药后第0d、7d、14d、21d测量肿瘤的最长径（A）和最宽径（B），根据公式[5]V=A×B2/2计算肿瘤体积。
1.5肺癌A549细胞体外的实验与观察
1.5.1MTT法测定ECP及DDP的毒性作用细胞接种于96孔板内，培养24h。根据预实验结果设置药物干预浓度，设置5个层次的DDP及ECP浓度，对照组加入培养液及同剂量的生理盐水。继续培养48h后，弃药液，加入MTT液和培养液，培养箱内孵育4h，用PBS液清洗两次，弃MTT液，加入二甲基亚砜，旋涡振荡器振荡10min充分溶解结晶。LOGIT法计算作用A549细胞48h后蜈蚣提取物对肺癌A549细胞的IC50值及IC10值。
1.5.2ECP联合DDP对体外A549细胞的作用按上述方法常规培养24h，分为两组，一组为不同浓度的ECP加入IC10浓度的DDP，一组为不同浓度的DDP加入IC10浓度的ECP。MTT法检测ECP及DDP的IC50值，合并指数（CI）根据公式计算[4]：CI=联合用药时A药IC50/A药单用时IC50+联合用药时B药IC50/B药单用时IC50。CI>1.05时具有拮抗作用；CI<0.95时表示两种药物具有协同作用；0.96
2结果
2.1裸鼠移植瘤体积的比较DDP+30mg/kgECP组裸鼠移植瘤给药后第0d、7d、14d、21d体积分别为98.7±9.1、123.7±8.9、154.5±9.1、193.8±13.5；DDP+60mg/kgECP组分别为103.5±12.4、114.7±9.6、138.8±12.1、169.3±11.4；DDP组分别为100.2±10.6、156.0±11.2、191.5±13.3、249.0±20.8；对照组分别为101.7±8.6、220.0±24.6、286.5±31.1、352.5±56.4。DDP组与DDP+ECP组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2ECP及DDP对人肺癌A549细胞的作用MTT结果显示，ECP及DDP均以剂量依赖的方式抑制人肺癌A549细胞，ECP的IC50值为1989.61μg/mL，IC10值为195.89μg/mL；DDP的IC50值为24.05μg/mL，IC10值为2.20μg/mL。DDP联用IC10浓度的ECP的IC50值为9.26μg/mL；ECP联用IC10浓度的DDP的IC50值为1100.43μg/mL，分别增效1.80倍和2.60倍，CI为0.93，CI<0.95，两种药物联用有协同作用。
3讨论
众多实验研究表明，蜈蚣提取物有多种作用[3]，课题采用人肺癌A549的细胞株作为本次实验的受试细胞。本研究体外实验表明，DDP与ECP联用具有协同作用。动物体内试验研究也显示DDP联合ECP可以抑制移植瘤生长速度。蜈蚣中存在抗癌活性的组分[4]；蜈蚣多种提取物有抗肿瘤的作用：蜈蚣多糖可Hela细胞阻滞于G2/M期，并诱导凋亡[5]。但研究只局限于整体水平，其具体有效成份仍不清楚，这也是今后需要继续努力研究的方向之一。
总之，本研究表明在体外及活体环境下蜈蚣提取物与顺铂联合运用对人肺癌A549有较明显的抑制作用，其联合用药的效果优于单用蜈蚣提取物或单用顺铂。
参考文献
[1]朱国民.蜈蚣在肿瘤方面的作用及研究进展[J].中国医师杂志，2008，10（6）：859-861.
[2]许亚军，林俊兵.蛋白提纯研究进展[J].天津化工，2006，20（4）：9-11.
[3]陈红琳，李小莉，甘明.墨江蜈蚣的药理作用[J].湖北中医杂志，2012，25（l）：501.
[4]曾红，张国刚，程巨龙.蜈蚣中抗癌活性成分的提取[J].湖南中医杂志，2004，5（20）：57-58.
[5]李兴暖，韩雅莉，余卫国.蜈蚣多糖对Hela细胞的增殖抑制作用研究[J].时珍国医国药，2009，20（7）：1571-1573.