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[摘要] 目的 分析评价生物芯片技术在肺癌血清肿瘤标记物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、细胞角蛋白19片段（cytokeratins 19，CYFRA211）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、鳞状上皮细胞癌抗原（squmaous cell carcinoma antigen，Scc）检测中运用的性能。 方法 通过精密度试验、线性试验和比对试验进行生物芯片技术在CEA、Scc、CYFRA211和NSE检测中的性能评价，运用SPSS 19.0统计学软件进行相关数据统计分析。 结果 精密度试验显示4个检测项目CV值均低于厂家设定值；线性试验显示4个项目R2均>0.95，线性范围符合实验要求；比对试验两套检测系统在进行多元回归分析后，R2均为0.314，拟合优度相同，可视为检测结果具有较高一致性。 结论 将生物芯片技术融合运用到化学发光免疫分析法中，对肺癌肿瘤血清标志物检测性能评价较好，能满足临床需求。
[关键词] 生物芯片；肺癌；血清标志物；性能评价
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）05-0098-03
生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉新技术，具有重大的基础研究价值。江苏三联SLXP-001全自动生物芯片阅读仪是基于微阵列化学发光免疫分析检测技术的全自动生物芯片分析系统，可用于肿瘤标志物的检测。本实验根据《医疗机构临床实验室管理办法》和《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189：2012）的要求，结合科室实际工作，参照美国国家临床实验室标准化研究所（CLSI）文件指南[1-3]，通过精密度试验、线性试验和比对试验进行生物芯片技术在肺癌血清标志物CEA、Scc、CYFRA211和NSE检测中的性能评价，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
所有检测标本均来自2016年8～10月汉川市人民医院临床新鲜血清样本，无明显溶血、黄疸及脂血。
1.2 仪器与试剂
江苏三联SLXP-001全自动生物芯片阅读仪，德国西门子Centaur XP全自动化学发光免疫分析仪，SLXP-001生物芯片批号：F160526E3，标准品和质控品批号：F160912K18；Centaur XP配套肺癌肿瘤血清标志物检测试剂：CEA（试剂批号130201003M，标准品和质控品批号02516082502），Scc（试剂批号130201018M，标准品和质控品批号06316092001），CYFRA211（试剂批号130201013M，标准品和质控品批号06216093001），NSE（试剂批号130201016M，标准品和质控品批号02316072502）。试剂均在有效期内使用。
1.3方法
实验前对仪器进行每日保养和质控检测并在控，严格按照仪器和试剂说明书进行实验操作。
1.3.1 精密度试验 分别选取CEA、Scc、CYFRA211和NSE的高、中、低三个浓度水平新鲜血清样本，每个浓度水平分别在SLXP-001上重复测定20次，计算其变异系数CV值；用高、中、低三个浓度水平质控品（厂家配套提供）连续测定20 d，计算其变异系数CV值，要求CV值低于厂家产品说明书。
1.3.2 线性试验 分别选择CEA、Scc、CYFRA211和NSE高浓度水平的临床血清样本，用SLXP-001专用稀释试剂做倍比稀释（1、1/2、1/4、1/8、1/16），配成5个系列浓度样本，用稀释试剂做空白样本，每个样本测定3次并进行均值计算；对样本的理论和检测浓度行线性回归并进行线性回归分析，计算相关系数R值，要求相关系数R2≥0.95。
1.3.3 比对试验 三联生物芯片阅读仪SLXP-001与西门子全自动化学发光免疫分析仪CENTAUR XP均应用双抗体夹心法原理定量检测人血清中的肿瘤标志物浓度，两台仪器检验原理相同，但检验方法及实验步骤不同，符合对两套检测系统进行临床比对的要求。分别选取20例临床确诊肺癌患者血清样本和20例非癌症患者血清样本（样本浓度覆盖不同水平），同时在两台仪器上测定CEA、Scc、CYFRA211和NSE4个项目，对两组检测结果进行回归分析，计算相关系数R值，比较R2拟合优度。
1.4 统计学处理
运用SPSS 19.0统计学软件进行相关数据处理及统计分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用配对χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。精密度试验采用线性回归分析；比对试验采用多元线性回归分析并计算其回归方程。
2结果
2.1精密度验证结果
CEA、Scc、CYFRA211和NSE的高、中、低三个浓度水平批内和批间不精密度CV均低于厂家说明书声明的CV值（CEA：CV高值<11.74%，低值<7.15%；Scc：CV高值<8.55%，低值<7.62%；CYFRA211：CV高值<7.36%，低值<6.47%；NSE：CV高值<6.93%，低值<6.54%），见表1。
2.2 线性范围验证结果
CEA线性实验相关方程Y=1.035X-0.700，R2=0.998，测量线性（1.68～288.60）ng/mL，试剂厂家指定线性（1～300）ng/mL；Scc线性实验相关方程Y=0.979X 0.168，R2=0.996，测量线性（0.88～92.77）ng/mL，試剂厂家指定线性（0.5～100）ng/mL；CYFRA211线性实验相关方程Y=0.998X-0.005，R2=0.999，测量线性（0.51～186.70）ng/mL，试剂厂家指定线性（0.65～200）ng/mL；NSE线性实验相关方程Y=0.994X 0.240，R2=0.998，测量线性（2.28～292.40）ng/mL，试剂厂家指定线性（2.6～300）ng/mL。 2.3比对试验结果
SLXP-001进行多元线性回归，得到回归方程Y=1.672-0.003X1-0.008X2-0.006X3 0.003X4（其中Y为样本类型，Y=1时表示为肺癌患者样本，Y=2时表示非肺癌患者样本，X1表示CEA值，X2表示Scc值，X3表示CYFRA211值，X4表示NSE值），Anova模型计算Sig值为0.009，Sig<0.05，证明所建立的回归方程有效，计算R值为0.560，R2为0.314；西门子CENTAUR XP进行多元线性回归，得到回归方程Y=1.678-0.003X1-0.008X2-0.005X3 0.001X4，Anova模型计算Sig值为0.009，Sig<0.05，证明所建立的回归方程有效，计算R值为0.560，R2为0.314。从R2拟合优度来看，两个模型的拟合优度相同，均为0.314，从结果来看，两个模型中最先进入“线性回归模型”的均是NSE值，见表2、3。
3讨论
SLXP-001型生物芯片阅读仪将生物芯片技术应用于化学发光免疫分析中，对血清标记物进行微阵列化学发光免疫分析，其主要优势是利用生物芯片技术避免常规仪器样本转移操作中的样本交叉污染，从而使仪器的准确率和重现性得到提高，进一步确保分析结果的准确性。SLXP-001利用蛋白芯片表面包被的抗体与患者血清中的抗原进行免疫反应，通过高灵敏制冷CCD检测蛋白芯片样本点的发光亮度来量化测定肿瘤血清标记物，其方法原理在该领域属于先进，但厂家的性能参数是在其合适的环境下测定得到的与本实验室实际的外部条件存在差异，在使用仪器日常检测前必须对仪器的性能进行验证[4-9]。
对SLXP-001芯片阅读仪进行精密度验证，实验结果显示CEA、Scc、CYFRA211和NSE的高、中、低三个浓度水平批内和批间不精密度CV均低于厂家说明书声明的CV值（CEA：CV高值<11.74%，低值<7.15%；Scc：CV高值<8.55%，低值<7.62%；CYFRA211：CV高值<7.36%，低值<6.47%；NSE：CV高值<6.93%，低值<6.54%），说明仪器的重复性较好，测定结果稳定。本研究对其批内和批间的CV值进行比较和相关性分析，CEA、Scc、CYFRA211和NSE的相关系数分别为0.998、0.996、0.999、0.998，R2均>0.95，说明SLXP-001无论在批内还是批间，其检测结果均具有很好的重复性，批内和批间因素不会影响其稳定性。
方法学比对一致是实验室质量控制管理的重要依据，对SLXP-001和CENTAUR XP两套检测系统比对实验测定结果分别进行多元线性回归分析，结果可见其R2拟合优度相同，均为0.314，说明从方法学一致的角度来讲，两套检测系统的测定结果具有高度的一致性。CENTAUR XP肺肿瘤标记物CEA、Scc、CYFRA211和NSE在我实验室2016年湖北省临检中心室间质评PT成绩为100，所以，我们认为SLXP-001的检测结果具有同样较高的准确性。对CEA、Scc、CYFRA211和NSE分别进行Pearson相关性统计，其相关系数分别为0.914、0.802、0.903、0.927（P均<0.05），可見Scc的测定结果较CEA、CYFRA211、NSE在两套检测系统上一致性略低，这可能与Scc在血清中的半衰期极短、稳定性较差有关。Scc的半衰期长短目前尚无有关的确切报道，Laure Ritti等[10]的研究报告中提到Scc的半衰期约为20 min，这显然与其他三种血清标记物相比其半衰期要短很多，另外温度、pH值、样本血脂含量等理化因素均会对其结果造成不同程度影响。SLXP-001线性范围验证结果与厂商指定线性相符，而本次检测标本的浓度，均在其有效检测浓度范围以内。
目前，化学发光免疫分析方法已成为国内外广泛认可并使用的检测肿瘤血清标记物的方法[11-13]，在科学技术不断发展以及强大的市场需求驱动下，各大医疗研究机构及厂商均不断将新的技术融合到化学发光技术中，生物芯片技术的引入，对化学发光技术的发展也开辟了新视野，其微量、低成本、少污染的优势也在技术发展中得到了很好的体现。本实验通过多方面的数据分析，对生物芯片技术在肿瘤血清标记物检测中的精密度、线性、重复性、准确性进行验证，确定其设计满足临床需求，但其临床解释也应充分考虑不同生产厂家、不同检测系统对结果造成的偏差，实验室应有专门的技术人员对不同检测系统间的结果进行评价分析，对偏差超出允许误差的结果予以校正，以保证临床结果的准确性和可比性，满足临床需求[14，15]。
[参考文献]
[1] Clinical and Laboratory Standards Institute. EP15-A2 Evaluation of Precision performance of quantitative measurement methods[S]. Wayne，PA，USA：CLSI，2008.
[2] National committee of clinical laboratory. EP6-A Evaluation of the Linearity of quantitative measurement procedures[S]. Wayne，PA，USA：NCCLS，2003.
[3] National committee for clinical laboratory. EP9-A2 Method comparison and biasestimation using patient samples[S]. Wayne，PA，USA：NCCLS：2002.
[4] 冯仁丰. 临床检验质量管理技术基础[M]. 第2版. 上海：上海科学技术文献出版社，2007：57-109. [5] 张莉，吴炯，郭玮，等. 医学检验检测系统应用前的性能评价[J].检验医学，2006，21（6）：560-563.
[6] 刘立民，李钰，蒙雨明，等. 化学发光微粒免疫分析技术检测输血四项的性能评估[J]. 现代检验医学杂志，2015， 30（2）：107-110.
[7] 龙琴，肖亚雄，唐灵通，等. 某品牌国产化学发光仪检测降钙素原的性能评价[J]. 国际检验医学杂志，2016， 37（14）：1998-1999.
[8] 鄂建飞，刘利洪，陈宗耀，等. Sysmex HISCL5000化学发光分析仪检测乙型肝炎标志物性能评价[J]. 国际检验医学杂志，2016，37（12）：1647-1650.
[9] 刘玉兰，孙艳艳. 迈克ISI200全自动化学发光测定仪的性能评价[J]. 国际检验医学杂志，2016，37（13）：1780-1781.
[10] Laure Ritti，Sanjay Kansra，Stefan W.Stoll，Differential ErbB Signaling in Squamous Cell versus Basal Cell Carcinoma of the Skin Y[J]. American Journal of Pathology，2008，18：165-171.
[11] 赵鹃，蔡力，刘洲，等. 国产ISI200全自动化学发光测定仪的临床应用评价[J]. 实用医院临床杂志，2014，11（4）：180-182.
[12] 汪晨，吴洁，宗晨，等. 化學发光免疫分析方法与应用进展[J]. 分析化学，2012，40（1）：3-10.
[13] 肖勤，林金明. 化学发光免疫分析方法的应用研究进展[J].分析化学，2015，43（6）：929-938.
[14] 张丽敏，吕虹，刘志伟，等. 两种化学发光仪检测甲状腺激素的性能评价[J]. 检验医学与临床，2016，13（21）：3001-3003.
[15] 杨有业，张秀明. 临床检验方法学评价[M]. 第2版. 北京：人民卫生出版社，2008：126-156.
（收稿日期：2016-12-23）
[关键词] 生物芯片；肺癌；血清标志物；性能评价
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）05-0098-03
生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉新技术，具有重大的基础研究价值。江苏三联SLXP-001全自动生物芯片阅读仪是基于微阵列化学发光免疫分析检测技术的全自动生物芯片分析系统，可用于肿瘤标志物的检测。本实验根据《医疗机构临床实验室管理办法》和《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189：2012）的要求，结合科室实际工作，参照美国国家临床实验室标准化研究所（CLSI）文件指南[1-3]，通过精密度试验、线性试验和比对试验进行生物芯片技术在肺癌血清标志物CEA、Scc、CYFRA211和NSE检测中的性能评价，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
所有检测标本均来自2016年8～10月汉川市人民医院临床新鲜血清样本，无明显溶血、黄疸及脂血。
1.2 仪器与试剂
江苏三联SLXP-001全自动生物芯片阅读仪，德国西门子Centaur XP全自动化学发光免疫分析仪，SLXP-001生物芯片批号：F160526E3，标准品和质控品批号：F160912K18；Centaur XP配套肺癌肿瘤血清标志物检测试剂：CEA（试剂批号130201003M，标准品和质控品批号02516082502），Scc（试剂批号130201018M，标准品和质控品批号06316092001），CYFRA211（试剂批号130201013M，标准品和质控品批号06216093001），NSE（试剂批号130201016M，标准品和质控品批号02316072502）。试剂均在有效期内使用。
1.3方法
实验前对仪器进行每日保养和质控检测并在控，严格按照仪器和试剂说明书进行实验操作。
1.3.1 精密度试验 分别选取CEA、Scc、CYFRA211和NSE的高、中、低三个浓度水平新鲜血清样本，每个浓度水平分别在SLXP-001上重复测定20次，计算其变异系数CV值；用高、中、低三个浓度水平质控品（厂家配套提供）连续测定20 d，计算其变异系数CV值，要求CV值低于厂家产品说明书。
1.3.2 线性试验 分别选择CEA、Scc、CYFRA211和NSE高浓度水平的临床血清样本，用SLXP-001专用稀释试剂做倍比稀释（1、1/2、1/4、1/8、1/16），配成5个系列浓度样本，用稀释试剂做空白样本，每个样本测定3次并进行均值计算；对样本的理论和检测浓度行线性回归并进行线性回归分析，计算相关系数R值，要求相关系数R2≥0.95。
1.3.3 比对试验 三联生物芯片阅读仪SLXP-001与西门子全自动化学发光免疫分析仪CENTAUR XP均应用双抗体夹心法原理定量检测人血清中的肿瘤标志物浓度，两台仪器检验原理相同，但检验方法及实验步骤不同，符合对两套检测系统进行临床比对的要求。分别选取20例临床确诊肺癌患者血清样本和20例非癌症患者血清样本（样本浓度覆盖不同水平），同时在两台仪器上测定CEA、Scc、CYFRA211和NSE4个项目，对两组检测结果进行回归分析，计算相关系数R值，比较R2拟合优度。
1.4 统计学处理
运用SPSS 19.0统计学软件进行相关数据处理及统计分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用配对χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。精密度试验采用线性回归分析；比对试验采用多元线性回归分析并计算其回归方程。
2结果
2.1精密度验证结果
CEA、Scc、CYFRA211和NSE的高、中、低三个浓度水平批内和批间不精密度CV均低于厂家说明书声明的CV值（CEA：CV高值<11.74%，低值<7.15%；Scc：CV高值<8.55%，低值<7.62%；CYFRA211：CV高值<7.36%，低值<6.47%；NSE：CV高值<6.93%，低值<6.54%），见表1。
2.2 线性范围验证结果
CEA线性实验相关方程Y=1.035X-0.700，R2=0.998，测量线性（1.68～288.60）ng/mL，试剂厂家指定线性（1～300）ng/mL；Scc线性实验相关方程Y=0.979X 0.168，R2=0.996，测量线性（0.88～92.77）ng/mL，試剂厂家指定线性（0.5～100）ng/mL；CYFRA211线性实验相关方程Y=0.998X-0.005，R2=0.999，测量线性（0.51～186.70）ng/mL，试剂厂家指定线性（0.65～200）ng/mL；NSE线性实验相关方程Y=0.994X 0.240，R2=0.998，测量线性（2.28～292.40）ng/mL，试剂厂家指定线性（2.6～300）ng/mL。 2.3比对试验结果
SLXP-001进行多元线性回归，得到回归方程Y=1.672-0.003X1-0.008X2-0.006X3 0.003X4（其中Y为样本类型，Y=1时表示为肺癌患者样本，Y=2时表示非肺癌患者样本，X1表示CEA值，X2表示Scc值，X3表示CYFRA211值，X4表示NSE值），Anova模型计算Sig值为0.009，Sig<0.05，证明所建立的回归方程有效，计算R值为0.560，R2为0.314；西门子CENTAUR XP进行多元线性回归，得到回归方程Y=1.678-0.003X1-0.008X2-0.005X3 0.001X4，Anova模型计算Sig值为0.009，Sig<0.05，证明所建立的回归方程有效，计算R值为0.560，R2为0.314。从R2拟合优度来看，两个模型的拟合优度相同，均为0.314，从结果来看，两个模型中最先进入“线性回归模型”的均是NSE值，见表2、3。
3讨论
SLXP-001型生物芯片阅读仪将生物芯片技术应用于化学发光免疫分析中，对血清标记物进行微阵列化学发光免疫分析，其主要优势是利用生物芯片技术避免常规仪器样本转移操作中的样本交叉污染，从而使仪器的准确率和重现性得到提高，进一步确保分析结果的准确性。SLXP-001利用蛋白芯片表面包被的抗体与患者血清中的抗原进行免疫反应，通过高灵敏制冷CCD检测蛋白芯片样本点的发光亮度来量化测定肿瘤血清标记物，其方法原理在该领域属于先进，但厂家的性能参数是在其合适的环境下测定得到的与本实验室实际的外部条件存在差异，在使用仪器日常检测前必须对仪器的性能进行验证[4-9]。
对SLXP-001芯片阅读仪进行精密度验证，实验结果显示CEA、Scc、CYFRA211和NSE的高、中、低三个浓度水平批内和批间不精密度CV均低于厂家说明书声明的CV值（CEA：CV高值<11.74%，低值<7.15%；Scc：CV高值<8.55%，低值<7.62%；CYFRA211：CV高值<7.36%，低值<6.47%；NSE：CV高值<6.93%，低值<6.54%），说明仪器的重复性较好，测定结果稳定。本研究对其批内和批间的CV值进行比较和相关性分析，CEA、Scc、CYFRA211和NSE的相关系数分别为0.998、0.996、0.999、0.998，R2均>0.95，说明SLXP-001无论在批内还是批间，其检测结果均具有很好的重复性，批内和批间因素不会影响其稳定性。
方法学比对一致是实验室质量控制管理的重要依据，对SLXP-001和CENTAUR XP两套检测系统比对实验测定结果分别进行多元线性回归分析，结果可见其R2拟合优度相同，均为0.314，说明从方法学一致的角度来讲，两套检测系统的测定结果具有高度的一致性。CENTAUR XP肺肿瘤标记物CEA、Scc、CYFRA211和NSE在我实验室2016年湖北省临检中心室间质评PT成绩为100，所以，我们认为SLXP-001的检测结果具有同样较高的准确性。对CEA、Scc、CYFRA211和NSE分别进行Pearson相关性统计，其相关系数分别为0.914、0.802、0.903、0.927（P均<0.05），可見Scc的测定结果较CEA、CYFRA211、NSE在两套检测系统上一致性略低，这可能与Scc在血清中的半衰期极短、稳定性较差有关。Scc的半衰期长短目前尚无有关的确切报道，Laure Ritti等[10]的研究报告中提到Scc的半衰期约为20 min，这显然与其他三种血清标记物相比其半衰期要短很多，另外温度、pH值、样本血脂含量等理化因素均会对其结果造成不同程度影响。SLXP-001线性范围验证结果与厂商指定线性相符，而本次检测标本的浓度，均在其有效检测浓度范围以内。
目前，化学发光免疫分析方法已成为国内外广泛认可并使用的检测肿瘤血清标记物的方法[11-13]，在科学技术不断发展以及强大的市场需求驱动下，各大医疗研究机构及厂商均不断将新的技术融合到化学发光技术中，生物芯片技术的引入，对化学发光技术的发展也开辟了新视野，其微量、低成本、少污染的优势也在技术发展中得到了很好的体现。本实验通过多方面的数据分析，对生物芯片技术在肿瘤血清标记物检测中的精密度、线性、重复性、准确性进行验证，确定其设计满足临床需求，但其临床解释也应充分考虑不同生产厂家、不同检测系统对结果造成的偏差，实验室应有专门的技术人员对不同检测系统间的结果进行评价分析，对偏差超出允许误差的结果予以校正，以保证临床结果的准确性和可比性，满足临床需求[14，15]。
[参考文献]
[1] Clinical and Laboratory Standards Institute. EP15-A2 Evaluation of Precision performance of quantitative measurement methods[S]. Wayne，PA，USA：CLSI，2008.
[2] National committee of clinical laboratory. EP6-A Evaluation of the Linearity of quantitative measurement procedures[S]. Wayne，PA，USA：NCCLS，2003.
[3] National committee for clinical laboratory. EP9-A2 Method comparison and biasestimation using patient samples[S]. Wayne，PA，USA：NCCLS：2002.
[4] 冯仁丰. 临床检验质量管理技术基础[M]. 第2版. 上海：上海科学技术文献出版社，2007：57-109. [5] 张莉，吴炯，郭玮，等. 医学检验检测系统应用前的性能评价[J].检验医学，2006，21（6）：560-563.
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[8] 鄂建飞，刘利洪，陈宗耀，等. Sysmex HISCL5000化学发光分析仪检测乙型肝炎标志物性能评价[J]. 国际检验医学杂志，2016，37（12）：1647-1650.
[9] 刘玉兰，孙艳艳. 迈克ISI200全自动化学发光测定仪的性能评价[J]. 国际检验医学杂志，2016，37（13）：1780-1781.
[10] Laure Ritti，Sanjay Kansra，Stefan W.Stoll，Differential ErbB Signaling in Squamous Cell versus Basal Cell Carcinoma of the Skin Y[J]. American Journal of Pathology，2008，18：165-171.
[11] 赵鹃，蔡力，刘洲，等. 国产ISI200全自动化学发光测定仪的临床应用评价[J]. 实用医院临床杂志，2014，11（4）：180-182.
[12] 汪晨，吴洁，宗晨，等. 化學发光免疫分析方法与应用进展[J]. 分析化学，2012，40（1）：3-10.
[13] 肖勤，林金明. 化学发光免疫分析方法的应用研究进展[J].分析化学，2015，43（6）：929-938.
[14] 张丽敏，吕虹，刘志伟，等. 两种化学发光仪检测甲状腺激素的性能评价[J]. 检验医学与临床，2016，13（21）：3001-3003.
[15] 杨有业，张秀明. 临床检验方法学评价[M]. 第2版. 北京：人民卫生出版社，2008：126-156.
（收稿日期：2016-12-23）