【摘 要】
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目的 原核表达兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60抗原区,并检测其免疫保护效果.方法 采用RT-PCR法从感染RHDV死兔肝脏中扩增RHDV VP60基因,
【机 构】
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重庆市畜牧科学院,重庆402460;重庆市兽用生物制品工程技术研究中心,重庆402460;西南大学荣昌校区,重庆402460
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目的 原核表达兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60抗原区,并检测其免疫保护效果.方法 采用RT-PCR法从感染RHDV死兔肝脏中扩增RHDV VP60基因,克隆基因并进行测序和生物信息学分析.用柔性连接肽(Gly4Ser)3串联VP60蛋白两抗原区域,根据E.coli密码子偏好性优化合成编码串联蛋白的DNA序列,插入至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒,转化感受态E.coli BL21 (DE3).挑选阳性克隆菌培养,用终浓度l mmol/L的IPTG诱导表达,产物经Ni2+-NTA金属螯合蛋白层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot检测.将纯化蛋白经背部皮下免疫家兔,1.0 mg/只,共免疫3次,每次间隔2周.分别于免疫前、首次免疫后14、28、42 d经耳静脉采血,分离血清,ELISA法检测RHDV抗体水平;末次免疫2周,经家兔腿部肌肉注射RHDV SZ/2013强毒株病毒液,2 mL/只,每天观察家兔症状,攻毒后10 d剖解观察脏器病理变化.结果 扩增的V P60基因序列与RHDV山东分离株VP60基因的核苷酸相似性最高,达95.86％,将该毒株命名为RHDV Chongqing/2016,明确了两抗原区段为VP60氨基酸序列的N-末端L区和C-末端H区.重组表达质粒经菌落PCR及测序鉴定,证明构建正确.纯化蛋白相对分子质量约50000,与兔抗RHDV多克隆抗体可发生特异性结合.家兔免疫14 d即产生了抗RHDV特异性抗体,随时间延长呈逐渐升高趋势,且较稳定;攻毒后10d内家兔无死亡,采食正常,无病症出现,保护率达100％;剖检可见家兔肝、肺和肾等脏器均正常,未见出血症状.结论 原核表达了RHDV衣壳蛋白VP60抗原区,且具有良好的免疫保护作用,本实验为相应疫苗的研发提供了实验依据.
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