建立可同时检测鸡细小病毒（Chicken parvovirus，ChPV）与禽呼肠病毒（Avian reovirus，ARV）的二重 PCR 方法，为防控 ChPV 与 ARV 提供技术支撑。根据鸡细小病毒 NS1基因和禽呼肠病毒σC 基因的保守序列，设计合成两对引物用于检测 ChPV 和 ARV，通过优化二重 PCR 的反应体系，特异性、敏感性试验评价建立的 ChPV 与 ARV 二重 PCR。优化后的二重 PCR 反应体系为：2× PCR Mix 12．5μL，其中ChPV 与 ARV 的上、下游引物各1．0μL，混合模板2．0μL，ddH2 O 补足25μL；最佳的反应程序为：95℃5 min；95℃1 min，56．1℃1 min，72℃1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。结果显示，建立的二重 PCR能够同时扩增出204 bp ChPV 和405 bp ARV 片段；该方法对 ChPV 与 ARV 的检测敏感性分别达到58 fg和53 fg，但对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒等病原体均无特异性扩增，对 ChPV 与 ARV 混合感染的临床阳性病料的检测结果与各病毒单项PCR 检测结果符合率为94％以上。建立的二重 PCR 可用于 ChPV 与 ARV 感染的快速鉴别诊断。