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摘 要 研究一种国外野生沉香乙醚提取物的生物活性并分析其化学成分，为国外野生沉香的进一步研究和开发利用提供一定的基础。采用乙醚浸提法提取沉香，对提取物分别用MTT法、Ellman法、pNPG法和贝曼漏斗法进行细胞毒、乙酰胆碱酯酶抑制、α-葡萄糖苷酶抑制和杀全齿复活线虫活性测试，利用GC-MS分析提取物化学成分。结果表明，该提取物对5株人体肿瘤细胞、乙酰胆碱酯酶、α-葡萄糖苷酶和全齿复活线虫均表现出一定的生物活性。GC-MS检测鉴定了其中的26个化合物，相对含量为57.39%，包括23个倍半萜类成分，相对含量为56.72%，1个2-（2-苯乙基）色酮类成分，相对含量为0.35%。本次对此种国外野生沉香的生物活性和化学成分研究，发现沉香乙醚提取物具有杀线虫的活性，为更好地开发沉香的药用价值提供了一定的科学依据。
关键词 野生沉香;生物活性;化学成分;GC-MS中图分类号 R284.1 文献标识码 A
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.021
沉香为瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属（Aquilaria）或拟沉香属 （Gyrinops）植物中含有树脂的木材[1-2]。迄今为止，《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅱ中，共收录沉香植物23种，其中有8种为拟沉香属植物，主要分布于中国的华南及西南、东南亚以及印度尼西亚群岛等地区[2-3]。沉香在医药、香薰、香水行业、宗教文化等领域应用广泛，是中国、日本、印度以及其他东南亚国家的传统名贵药材和天然香料[3-4]。近年来，沉香因其良好的应用价值和高贵稀有的特性受到广泛关注，沉香贸易目前也保持高速增长的势头。沉香的研究涉及许多方面，其生物活性也受到了国内外关注，目前发现沉香具有神经保护、镇痛、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、解痉、降血糖、治疗过敏及改善慢性肾衰竭等作用[5-11]。
国内外学者通过对沉香化学成分的研究，发现沉香中的特征性成分为2-（2-苯乙基）色酮和倍半萜两类化合物[12-13]。2-（2-苯乙基）色酮类化合物包括四氢色酮、双环氧色酮、单环氧色酮、flidersia类型色酮和色酮聚合物等。倍半萜类化学物主要有以下九类：沉香呋喃（agarofuran）型、沉香螺旋烷（agarospirane）型、愈创木烷（guaiane）型、桉烷（eudesmane）型、艾里莫芬烷（eremophilane）型、杜松烷（cadinane）型、前香草烷（prezizaane）型、菖蒲烷（acorane）型、蛇麻烷（humulene）型等。沉香中色酮和倍半萜化合物种类和數量的不同，一定程度上导致了沉香的质量、香味等差异。
目前，沉香中特征性成分的分析方法很多，如紫外分光光度法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC/UPLC-MS）等，其中各类联用的方法能更准确分析指认沉香的化学成分。
本文以一种国外的野生沉香作为研究对象，对其乙醚提取物进行了细胞毒、乙酰胆碱酯酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性和全齿复活线虫致死活性等生物活性测试，并对其化学成分进行GC-MS分析鉴定，研究结果为国外野生沉香的进一步研究和开发利用提供了一定的研究基础。
1.1 材料
1.1.1 沉香样品 一种国外野生沉香样品于2014年8月购买于泰国曼谷，经分子生物学鉴定，其源植物为沉香属（Aquilaria）植物的一种，但由于目前全世界分子鉴定基因库还未收录所有沉香属植物的信息，因此并不能确定其具体的种名。凭证标本（201408SLLK）存放于中国热带农业科学院热带生物技术研究所（图1）。
1.1.2 细胞与试剂 人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞BEL-7402、人慢性髓原白血病细胞K562、人宫颈癌细胞Hela和人肺腺癌细胞A549（中山大学实验动物中心细胞库）;阳性对照紫杉醇（江苏红豆杉药业有限公司）;RPMI1640完全培养基（Solarbio公司）;DMEM低糖培养基（Hyclone公司）;碘化硫代乙酰胆碱、5，5′-二硫-双-2-硝基苯甲酸（DTNB）、他克林（Tacrine，纯度99%）、α-糖苷酶（酵母来源）（Sigma公司）;乙酰胆碱酯酶（Solarbio）;阿卡波糖、对硝基苯-α-葡萄糖苷 （pNPG）、碳酸钠（国药集团化学试剂有限公司）;线虫Panagrellus redivivus，燕麦片（天津市富宇精细化工有限公司）;DMSO（西陇化工股份有限公司）;无水乙醚（天津市化学试剂一厂）;GC-MS中使用的试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。
1.1.3 仪器与设备 HP6890/5975C GC-MS联用仪、HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱（美国安捷伦公司）;ELX-800酶标仪（美国宝特公司）;UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津公司）;HHB11360-S普通培养箱（上海跃进医疗器械厂）;SW-40洁净工作台（上海博迅实业有限公司）;BP221S万分之一电子秤（北京赛多利斯天平有限公司）;HVE-50高压蒸汽灭菌锅（日本HIRAYAMA公司）。 1.2 方法
1.2.1 样品制备 一种国外野生沉香样品20.0 g粉碎，以50 mL无水乙醚超声提取30 min，静置5 min后过滤得到乙醚提取液，重复3次，合并3次提取液，挥干后得到该沉香的油状乙醚提取物1.5 g待用。
1.2.2 细胞毒活性测试 采用MTT法[14]测定样品对人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞BEL-7402、人慢性髓原白血病细胞K562、人宫颈癌细胞Hela和人肺腺癌细胞A549五株细胞的抑制活性。样品活性结果以IC50（半数抑制浓度）表示，当抑制率为50%时的样品质量浓度也就是细胞毒活性的IC50值。
1.2.3 乙酰胆碱酯酶抑制活性测试 采用Ellman法[15]测定样品对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。样品活性结果以其对乙酰胆碱酯酶的抑制率表示。
1.2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性测试 采用pNPG法[16]测定样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。样品活性结果以样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率表示。
1.2.5 全齿复活线虫致死活性测试 采用贝曼漏斗法[17]测定样品对全齿复活线虫Panagrellus redivivus的致死活性。样品活性结果以样品对全齿复活线虫的致死率表示。
1.2.6 GC-MS分析条件 色谱条件：HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane 弹性石英毛细管柱;初始柱温50 ℃，保持2 min;以5 ℃/min的速率升温
至310 ℃，保持10 min;汽化室温度250 ℃;载气为高纯He（99.999%）;柱前压7.62 psi（1 psi = 6.895 kPa），载气流量1.0 mL/min;分流比40∶1，溶剂延迟时间3.0 min。
质谱条件：电子轰击（EI）离子源、电子能量70 eV、离子源温度230 ℃、四极杆温度150 ℃、接口温度280 ℃、发射电流34.6 μA、倍增器电压1 434 V、质量扫描范围20～550 m/z。
2.1 生物活性测试结果
从表1可知，国外野生沉香乙醚提取物对人慢性髓原白血病细胞K562、人肝癌细胞BEL-7402、人胃癌细胞SGC-7901、人肺腺癌细胞A549和人宫颈癌细胞Hela均表现出一定的抑制活性，其中以人肺腺癌細胞A549的活性相对较好，IC50为（28.02±0.94） g/mL。国外野生沉香乙醚提取物对乙酰胆碱酯酶和α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性，其中对α-葡萄糖苷酶的抑制活性接近阳性对照（表2）。沉香乙醚提取物对全齿复活线虫具有较高的致死率，其致死率为45.59%± 0.92%，高于阳性对照的31.64%±3.64%。
2.2 GC-MS分析结果
该种国外野生沉香样品乙醚提取物的总离子流图见图2，该沉香乙醚提取物中经GC-MS检测鉴定了26个成分（表3），总相对含量为57.39%;其中倍半萜类化合物23个，相对含量为56.72%;色酮类化合物1个，相对含量为0.35%;芳香性化合物1个，相对含量为0.17%;豆甾醇1个，相对含量为0.15%。
本研究采用乙醚冷浸超声提取法提取一种国外野生沉香，其乙醚提取物的得率为7.50%，与普通沉香乙醚提取得率（1.3%～9.7%）[19]相符。据报道，沉香中一些倍半萜成分对中枢神经系统具有抑制和安定的作用[10， 22-24]，色酮类成分具有神经细胞保护作用[25-26]。这些生物活性研究多数针对单体化合物，而粗提物的生物活性研究相对较少且研究单一[27-28]。基于前人对沉香生物活性的研究及本课题组的研究条件，本研究对该沉香乙醚提取物进行细胞毒活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和全齿复活线虫致死活性测试。乙酰胆碱酯酶是水解乙酰胆碱的特异性胆碱酯酶，而乙酰胆碱含量降低会引发神经退行性疾病。本研究发现该种沉香乙醚提取物对乙酰胆碱酯酶具有一定强度的抑制活性，说明其对神经系统具有保护作用。本研究中发现此种沉香乙醚提取物对人慢性髓原白血病细胞K562、人肝癌细胞BEL-7402、人胃癌细胞SGC-7901、人肺腺癌细胞A549和人宫颈癌细胞Hela的细胞均表现出一定的抑制活性，说明其有一定的抗肿瘤作用。α-葡萄糖苷酶分布于小肠刷状缘膜上皮细胞上，是水解碳水化合物的关键酶，他能从低聚糖类底物的非还原端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，葡萄糖经小肠吸收进入血液，导致血糖水平的上升，故抑制α-葡萄糖苷酶的活性能够延缓碳水化合物的消化，减缓葡萄糖的吸收，抑制餐后高血糖。本研究发现该沉香乙醚提取物对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，说明其具有降血糖的作用。本研究还发现该沉香乙醚提取物对全齿复活线虫表现出较高的致死率，这也说明沉香具有杀线虫的活性。 本研究对基源植物为沉香属植物的一种国外野生沉香进行GC-MS分析鉴定，结果发现26个化学成分，其中倍半萜类成分23个，2-（2-苯乙基）色酮类成分1个，芳香性成分1个，甾体类成分1个，另外还有许多成分无法鉴定出，从其质谱图分析绝大部分属于倍半萜类成分。本研究鉴定出的倍半萜有菖蒲烷、愈创木烷、桉烷和艾里莫芬烷等沉香常见骨架类型，与报道的倍半萜骨架类型基本一致;而许多未能鉴定结构的倍半萜类成分表明，本研究所选用的国外野生沉香中可能含有多种结构新颖的倍半萜成分。除此之外，本研究还鉴定出了沉香的另一种主要特征性成分，即2-（2-苯乙基）色酮类成分。
本研究通过初步的活性研究，为更好的开发国外野生沉香的药用價值提供了一定的研究基础，同时采用GC-MS分析该沉香中的化学成分，为进一步追踪活性物质以及揭示国外野生沉香的化学成分特点提供了一定的科学依据。
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关键词 野生沉香;生物活性;化学成分;GC-MS中图分类号 R284.1 文献标识码 A
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沉香为瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属（Aquilaria）或拟沉香属 （Gyrinops）植物中含有树脂的木材[1-2]。迄今为止，《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅱ中，共收录沉香植物23种，其中有8种为拟沉香属植物，主要分布于中国的华南及西南、东南亚以及印度尼西亚群岛等地区[2-3]。沉香在医药、香薰、香水行业、宗教文化等领域应用广泛，是中国、日本、印度以及其他东南亚国家的传统名贵药材和天然香料[3-4]。近年来，沉香因其良好的应用价值和高贵稀有的特性受到广泛关注，沉香贸易目前也保持高速增长的势头。沉香的研究涉及许多方面，其生物活性也受到了国内外关注，目前发现沉香具有神经保护、镇痛、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、解痉、降血糖、治疗过敏及改善慢性肾衰竭等作用[5-11]。
国内外学者通过对沉香化学成分的研究，发现沉香中的特征性成分为2-（2-苯乙基）色酮和倍半萜两类化合物[12-13]。2-（2-苯乙基）色酮类化合物包括四氢色酮、双环氧色酮、单环氧色酮、flidersia类型色酮和色酮聚合物等。倍半萜类化学物主要有以下九类：沉香呋喃（agarofuran）型、沉香螺旋烷（agarospirane）型、愈创木烷（guaiane）型、桉烷（eudesmane）型、艾里莫芬烷（eremophilane）型、杜松烷（cadinane）型、前香草烷（prezizaane）型、菖蒲烷（acorane）型、蛇麻烷（humulene）型等。沉香中色酮和倍半萜化合物种类和數量的不同，一定程度上导致了沉香的质量、香味等差异。
目前，沉香中特征性成分的分析方法很多，如紫外分光光度法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC/UPLC-MS）等，其中各类联用的方法能更准确分析指认沉香的化学成分。
本文以一种国外的野生沉香作为研究对象，对其乙醚提取物进行了细胞毒、乙酰胆碱酯酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性和全齿复活线虫致死活性等生物活性测试，并对其化学成分进行GC-MS分析鉴定，研究结果为国外野生沉香的进一步研究和开发利用提供了一定的研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 沉香样品 一种国外野生沉香样品于2014年8月购买于泰国曼谷，经分子生物学鉴定，其源植物为沉香属（Aquilaria）植物的一种，但由于目前全世界分子鉴定基因库还未收录所有沉香属植物的信息，因此并不能确定其具体的种名。凭证标本（201408SLLK）存放于中国热带农业科学院热带生物技术研究所（图1）。
1.1.2 细胞与试剂 人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞BEL-7402、人慢性髓原白血病细胞K562、人宫颈癌细胞Hela和人肺腺癌细胞A549（中山大学实验动物中心细胞库）;阳性对照紫杉醇（江苏红豆杉药业有限公司）;RPMI1640完全培养基（Solarbio公司）;DMEM低糖培养基（Hyclone公司）;碘化硫代乙酰胆碱、5，5′-二硫-双-2-硝基苯甲酸（DTNB）、他克林（Tacrine，纯度99%）、α-糖苷酶（酵母来源）（Sigma公司）;乙酰胆碱酯酶（Solarbio）;阿卡波糖、对硝基苯-α-葡萄糖苷 （pNPG）、碳酸钠（国药集团化学试剂有限公司）;线虫Panagrellus redivivus，燕麦片（天津市富宇精细化工有限公司）;DMSO（西陇化工股份有限公司）;无水乙醚（天津市化学试剂一厂）;GC-MS中使用的试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。
1.1.3 仪器与设备 HP6890/5975C GC-MS联用仪、HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱（美国安捷伦公司）;ELX-800酶标仪（美国宝特公司）;UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津公司）;HHB11360-S普通培养箱（上海跃进医疗器械厂）;SW-40洁净工作台（上海博迅实业有限公司）;BP221S万分之一电子秤（北京赛多利斯天平有限公司）;HVE-50高压蒸汽灭菌锅（日本HIRAYAMA公司）。 1.2 方法
1.2.1 样品制备 一种国外野生沉香样品20.0 g粉碎，以50 mL无水乙醚超声提取30 min，静置5 min后过滤得到乙醚提取液，重复3次，合并3次提取液，挥干后得到该沉香的油状乙醚提取物1.5 g待用。
1.2.2 细胞毒活性测试 采用MTT法[14]测定样品对人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞BEL-7402、人慢性髓原白血病细胞K562、人宫颈癌细胞Hela和人肺腺癌细胞A549五株细胞的抑制活性。样品活性结果以IC50（半数抑制浓度）表示，当抑制率为50%时的样品质量浓度也就是细胞毒活性的IC50值。
1.2.3 乙酰胆碱酯酶抑制活性测试 采用Ellman法[15]测定样品对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。样品活性结果以其对乙酰胆碱酯酶的抑制率表示。
1.2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性测试 采用pNPG法[16]测定样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。样品活性结果以样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率表示。
1.2.5 全齿复活线虫致死活性测试 采用贝曼漏斗法[17]测定样品对全齿复活线虫Panagrellus redivivus的致死活性。样品活性结果以样品对全齿复活线虫的致死率表示。
1.2.6 GC-MS分析条件 色谱条件：HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane 弹性石英毛细管柱;初始柱温50 ℃，保持2 min;以5 ℃/min的速率升温
至310 ℃，保持10 min;汽化室温度250 ℃;载气为高纯He（99.999%）;柱前压7.62 psi（1 psi = 6.895 kPa），载气流量1.0 mL/min;分流比40∶1，溶剂延迟时间3.0 min。
质谱条件：电子轰击（EI）离子源、电子能量70 eV、离子源温度230 ℃、四极杆温度150 ℃、接口温度280 ℃、发射电流34.6 μA、倍增器电压1 434 V、质量扫描范围20～550 m/z。
2 结果与分析
2.1 生物活性测试结果
从表1可知，国外野生沉香乙醚提取物对人慢性髓原白血病细胞K562、人肝癌细胞BEL-7402、人胃癌细胞SGC-7901、人肺腺癌细胞A549和人宫颈癌细胞Hela均表现出一定的抑制活性，其中以人肺腺癌細胞A549的活性相对较好，IC50为（28.02±0.94） g/mL。国外野生沉香乙醚提取物对乙酰胆碱酯酶和α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性，其中对α-葡萄糖苷酶的抑制活性接近阳性对照（表2）。沉香乙醚提取物对全齿复活线虫具有较高的致死率，其致死率为45.59%± 0.92%，高于阳性对照的31.64%±3.64%。
2.2 GC-MS分析结果
该种国外野生沉香样品乙醚提取物的总离子流图见图2，该沉香乙醚提取物中经GC-MS检测鉴定了26个成分（表3），总相对含量为57.39%;其中倍半萜类化合物23个，相对含量为56.72%;色酮类化合物1个，相对含量为0.35%;芳香性化合物1个，相对含量为0.17%;豆甾醇1个，相对含量为0.15%。
3 结论
本研究采用乙醚冷浸超声提取法提取一种国外野生沉香，其乙醚提取物的得率为7.50%，与普通沉香乙醚提取得率（1.3%～9.7%）[19]相符。据报道，沉香中一些倍半萜成分对中枢神经系统具有抑制和安定的作用[10， 22-24]，色酮类成分具有神经细胞保护作用[25-26]。这些生物活性研究多数针对单体化合物，而粗提物的生物活性研究相对较少且研究单一[27-28]。基于前人对沉香生物活性的研究及本课题组的研究条件，本研究对该沉香乙醚提取物进行细胞毒活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和全齿复活线虫致死活性测试。乙酰胆碱酯酶是水解乙酰胆碱的特异性胆碱酯酶，而乙酰胆碱含量降低会引发神经退行性疾病。本研究发现该种沉香乙醚提取物对乙酰胆碱酯酶具有一定强度的抑制活性，说明其对神经系统具有保护作用。本研究中发现此种沉香乙醚提取物对人慢性髓原白血病细胞K562、人肝癌细胞BEL-7402、人胃癌细胞SGC-7901、人肺腺癌细胞A549和人宫颈癌细胞Hela的细胞均表现出一定的抑制活性，说明其有一定的抗肿瘤作用。α-葡萄糖苷酶分布于小肠刷状缘膜上皮细胞上，是水解碳水化合物的关键酶，他能从低聚糖类底物的非还原端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，葡萄糖经小肠吸收进入血液，导致血糖水平的上升，故抑制α-葡萄糖苷酶的活性能够延缓碳水化合物的消化，减缓葡萄糖的吸收，抑制餐后高血糖。本研究发现该沉香乙醚提取物对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，说明其具有降血糖的作用。本研究还发现该沉香乙醚提取物对全齿复活线虫表现出较高的致死率，这也说明沉香具有杀线虫的活性。 本研究对基源植物为沉香属植物的一种国外野生沉香进行GC-MS分析鉴定，结果发现26个化学成分，其中倍半萜类成分23个，2-（2-苯乙基）色酮类成分1个，芳香性成分1个，甾体类成分1个，另外还有许多成分无法鉴定出，从其质谱图分析绝大部分属于倍半萜类成分。本研究鉴定出的倍半萜有菖蒲烷、愈创木烷、桉烷和艾里莫芬烷等沉香常见骨架类型，与报道的倍半萜骨架类型基本一致;而许多未能鉴定结构的倍半萜类成分表明，本研究所选用的国外野生沉香中可能含有多种结构新颖的倍半萜成分。除此之外，本研究还鉴定出了沉香的另一种主要特征性成分，即2-（2-苯乙基）色酮类成分。
本研究通过初步的活性研究，为更好的开发国外野生沉香的药用價值提供了一定的研究基础，同时采用GC-MS分析该沉香中的化学成分，为进一步追踪活性物质以及揭示国外野生沉香的化学成分特点提供了一定的科学依据。
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