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摘要：采用电化学法在滴涂纳米氧化锌（Zn0）的玻碳电极（GCE）上聚合修饰1H-咪唑-4-甲酸（HIMC），制得聚1H-咪唑-4-甲酸一纳米ZnO（PHIMC-ZnO）复合膜修饰的GCE（ PHIMC-ZnO/GCE），并用扫描电子显微镜（SEM）及电化学方法对修饰电极的形貌和电化学特性进行了表征.利用循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV）研究了抗坏血酸（AA）、多巴胺（DA）和尿酸（UA）在该修饰电极上的电化学行为，结果表明：在pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，PHIMC-ZnO/GCE对AA，DA和UA均具有良好的电催化作用.在优化的实验条件下，AA，DA和UA的物质的量浓度线性范围分别为80～1400，0.15～45.00和2-120 umol·L-1，相关系数分别为0.998 0，0.993 7和0.998 3，检出限（S/N=3）分别为0.50，0.03和0.09 umol·L-1.AA，DA和UA在不同扫速下的电化学行为表明：AA，DA和UA在PHIMC-ZnO/GCE上的电极过程受吸附过程控制，将PHIMC-ZnO/GCE应用于尿样和血清中AA，DA和UA的同时测定，结果令人满意.
关键词：1H-咪唑-4-甲酸（HIMC）;纳米氧化锌（Zn0）;抗坏血酸（AA）;多巴胺（DA）;尿酸（UA）
中图分类号：0 657.1
文献标志码：A
文章编号：1000-5137（2020）02-0191-12
0引 言
抗坏血酸（AA）又叫维生素C，是维持人体健康必需的一种水溶性维生素，在体内生物合成及物质代谢中发挥重要作用[1-2]，人体中AA含量不足会引发坏血病、牙龈出血和牙齿脱落等疾病[3-4]，因此对AA的定量分析在食品和医药等领域相当重要.多巴胺（DA）是哺乳类动物中枢神经系统中重要的神经递质[5]，人体内DA含量失调会引发心脏病、帕金森病等疾病6-7J.此外，DA类物质还具有兴奋心脏、增加肾血流量的作用，可用于治疗心肌梗死、肾功能衰竭等引起的休克综合征[8].因此，DA浓度的准确测定对于神经生理学研究、疾病诊断及相关药物的质量控制也尤为重要.尿酸（UA）是人体中嘌呤的最终代谢产物[9]，是尿液和血液中的一种重要物质.人体内UA含量异常时会导致糖尿病、痛风、白血病和高血压等疾病[10]，因此，对人体中AA，DA和UA含量的测定具有医学和生命科学意义.
目前，对于AA，DA和UA等生物分子的检测主要采用化学发光法[11]、高效液相色谱法[12]、毛细管电泳法[13]及电化学方法[14-15]等.在这些方法中，电化学方法因操作简单、成本低廉、灵敏度高等优点而被广泛关注.然而，由于AA，DA和UA共存于生物体液中，且三者在裸电极上具有较高的相互接近的氧化过电位，因此很难对三者进行同时测定.基于此，本文作者首先采用滴涂法將纳米氧化锌（Zn0）修饰在玻碳电极（GCE）上制备纳米Zn0修饰的GCE （ZnO/GCE），然后在ZnO/GCE上电聚合1H-咪唑-4-甲酸（ HIMC）制得聚1H-咪唑-4-甲酸一纳米ZnO（PHIMC-Zn0）复合膜修饰的GCE（ PHIMC-ZnO/GCE）.该复合膜能有效结合HIMC的电化学活性和纳米Zn0良好的生物相容性及高的电子传递特性，使其呈现出独特的性质[16]，将该PHIMC-ZnO/GCE应用于尿样和血清中AA，DA和UA的同时检测，结果令人满意.
1实验部分
1.1仪器与试剂
PCSTAT128N型AUTOLAB电化学工作站，瑞士万通;雷磁pHS-25型精密pH计，上海精密科学仪器有限公司;SJ-1200型超声波清洗器，上海洁净超声波设备厂;三电极体系：表面修饰玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极（ SCE）为参比电极，盘状铂丝电极为辅助电极;S-4800场发射扫描电子显微镜（SEM），日本日立;差分脉冲伏安法（DPV）实验的测试电位范围为-0.2-0.8 V，扫速为0.05 V·s-l，脉冲幅度为0.025 V·s-1，频率为0.5 s，脉冲宽度为0.06 s，所有电化学测试均在室温（20+3）℃下完成，溶液和电极保持静止;电化学阻抗（ EIS）测量均在含1 mmol·L-1K，Fe（CN）6，1 mmol·L-1K4Fe（CN）6及0.1 moI.L_lKNO3的混合液中进行，开路电位为0.19 V，频率范围为0.01-100 kHz.
HIMC，Aladdin;Zn0，上海笛柏化学品技术有限公司;AA，上海曹杨二中化工厂;DA，Sigma;UA，Sigma;磷酸盐缓冲溶液（PBS），pH值为4.0—9.0，由0.1 mol·L-1的NaH2PO4和Na2HPO4溶液配制;其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水.
1.2修饰电极的制备
PHIMC-ZnO/GCE的制备：称取8 mg纳米Zn0分散在10 mL超纯水中并超声5 min，配制Zn0分散液.在进行表面修饰之前，将GCE依次用0.3 um和0.05 um的氧化铝（Al202）粉抛光至镜面，用蒸馏水冲洗后，依次在无水乙醇和蒸馏水中各超声清洗2 min，高纯氮气（N2）吹干，室温保存，取6uL Zn0分散液滴于GCE表面，室温下晾干，然后在含有0.01 mol.L-l HIMC的0.1 mol·L-1H2SO4溶液中，对制得PHIMC -ZnO/GCE用循环伏安法（CV）在-0.6+1.8V电位范围内以0.05 V·s-1的扫速循环扫描15圈.修饰电极置于0.1 mol·L-l pH值为7.0的PBS溶液中室温保存、备用，
聚1H-咪唑-4-甲酸修饰的GCE（ PHIMC/GCE）的制备：将GCE置于含有0.01 mol·L-1 HIMC的0.1mol·L-l H2SO4溶液中，用循环伏安法在-0.6 +1.8 V电位范围内以0.05 V·s-1的扫速循环扫描15圈制得PHIMC/GCE. ZnO/GCE的制备：将6uL Zn0分散液滴涂到GCE表面，室温下晾干即可制得ZnO/GCE.
2结果与讨论
2.1修饰电极的制备与表征
2.1.1
HIMC在ZnO/GCE上的电化学聚合
图l为ZnO/GCE在含有0.01 mol·L-1 HIMC的0.1 mol·L-lH2SO4溶液中电聚合15圈后的CV图.由图l中内插图（b）可以看出，在扫描的第一圈，出现了1个峰电位位于1.09 V的氧化峰和2个分别位于-0.37 V和0.61 V微弱的还原峰.其中，峰电位位于1.09 V的氧化峰归因于HIMC失去1个e发生氧化反应生成1H-咪唑-4-甲酸自由基（HIMC+）;位于-0.37 V和0.61 V的还原峰为HIMC+与其单体或HIMC+之间发生化学反应生成的1H-咪唑-4-甲酸二聚体或低聚物的还原所致.
随着扫描的持续进行，位于1.09 V的氧化峰逐渐减弱消失，而在1.55 V处出现了一个新的微弱的氧化峰.这是由于在第1圈中生成的HIMC+与其单体或HIMC+之间发生化学反应生成的HIMC的二聚体或低聚物的再氧化所致.随着反应的持续进行，溶液中HIMC的浓度逐渐减小，电极表面发生电氧化的HIMC的分子数也不断减少，从而导致位于1.09 V处的氧化峰逐渐减弱，直至消失;随着扫描圈数的增加，位于1.55 V处的氧化峰和位于-0.37 V和0.61 V的还原峰的峰电流逐渐增大，直至基本稳定.这些电化学行为表明PHIMC在ZnO/GCE上的形成，且在15圈后基本稳定.
2.1.2修饰电极的表面形貌
图2（a），2（b）和2（c）分别为PHIMC/GCE，ZnO/GCE和PHIMC-ZnO/GCE的SEM图，由图2可知，PHIMC/GCE，ZnO/GCE和PHIMC-ZnO/CCE表面分别呈现出不同的结构形貌.其中，图2（a）中PHIMC膜呈现出“方糖”状的块状结构，颗粒的直径约为10～40um;图2（b）中的ZnO/CCE表面呈现出“棒一块”状交替的非均匀结构，直径约为30～100 nm，长度约为1～5 um;图2（c）显示，当在ZnO/GCE上进一步修饰PHIMC后，在电极表面形成了一层紧致复合膜，这种复合膜结构为生物分子的负载及其电催化氧化提供了良好的活性平台.
2.1.3 EIS表征
EIS是用于测试电极界面动力学屏障的工具，常用来研究在改性过程中电极表面的阻抗变化.EIS谱包括一个位于高频区的半圆部分和一个位于低频区的直线部分，高频区的半圆部分对应电子传递受限过程，低频区的直线部分对应电子传递扩散过程.为了进一步考察各聚合物膜在电极表面的导电性，分别对GCE（曲线a），PHIMC/GCE（曲线b），PHIMC-ZnO/GCE（曲线c）和ZnO/GCE（内插图）在等物质的量浓度的Fe（CN）63-/4-溶液中的EIS谱进行了研究，如图3所示，
由图3可知，GCE的电荷交换电阻（Ret）約为1470 Ω（曲线a）;当在GCE表面修饰PHIMC膜时，其Ret值增加到约4 340Ω（曲线b），表明PHIMC膜对电子传递有阻碍作用;当在GCE表面修饰Zn0膜时，其Ret值降低到约1149 Q（内插图曲线d），表明纳米Zn0具有较高的电子传递特性，促进了电极的电子传递速率;当在GCE表面修饰PHIMC-Zn0复合膜后，它的Ret值显著降低到约1270Ω（曲线c），表明复合膜能有效地促进了电极表面电子的传递，同时也表明了PHIMC-Zn0复合膜已修饰到电极表面.
2.2 AA，DA和UA在修饰电极上的电化学氧化
为了研究AA，DA和UA在修饰电极上的电化学行为，图4（a），4（b）和4（c）分别展示了1 000 umol·L-lAA，130 umol·L-1 DA和180 umol·L-l UA在GCE（曲线1）、PHIMC/GCE（曲线2）、ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上的伏安响应.
从图4（a）可以看出，在GCE（曲线1）上，AA呈现出一个位于0.12 V处宽的弱氧化峰;在PHIMC/GCE（曲线2）上，AA的氧化峰电位为0.09 V.与裸GCE相比，AA在PHIMC/GCE上不仅具有较低的氧化过电位，且其氧化峰电流是裸GCE上峰电流的2.6倍;在ZnO/GCE（曲线3）上，AA具有比其在PHIMC/GCE上更低的氧化峰电位（0.07 V）;在PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上，AA的氧化峰电位为0.08 V.与裸GCE相比，AA在PHIMC-ZnO/GCE上不仅具有较低的氧化过电位，而且其氧化峰电流也大大增加，为其在裸GCE上峰电流值的3.5倍.由此可知，与裸GCE相比，AA在PHIMC/GCE，ZnO/GCE和PHIMC-ZnO/GCE上都有较低的氧化过电位和较强的峰电流响应，表明此3种修饰电极对AA的电化学氧化都具有催化作用，而其中催化作用最为显著的为复合膜修饰的PHIMC-ZnO/GCE电极.
从图4（b）可以看出，在GCE（曲线1）上，DA在0.22 V处呈现出一个很宽的弱氧化峰，而在PHIMC/GCE（曲线2），ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上，DA的氧化过电位均负移，分别为0.17，0.15及0.16 V，且峰电流均增大，分别为DA在GCE上峰电流的2.0，2.5及3.0倍，其中表现最为突出的为PHIMC-ZnO/GCE.在该复合膜修饰的GCE上，DA的氧化峰负移到0.16V处，较裸GCE减小0.06V，且峰电流为其在裸GCE上的3.0倍，这说明PHIMC-ZnO/GCE对DA有较好的催化氧化作用.
从图4（c）可以看出，在GCE（曲线1）上，UA在0.34 V处呈现出一个很宽的弱氧化峰，而在PHIMC/GCE（曲线2），ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上，UA的氧化过电位均负移，分别为0.28，0.32及0.27 V，且峰电流均增大，分别为UA在GCE上峰电流的5.9，3.1及8.5倍.由此可见，这3种修饰电极对UA的电化学氧化都具有催化作用，其中PHIMC-ZnO/GCE对UA的催化氧化作用最为突出. 2.3 PHIMC-ZnO/GCE对混合液中AA，DA和UA的电化学区分
为了考察PHIMC-ZnO/GCE的实用性，分别采用CV法和DPV法研究了AA，DA和UA的混合液在GCE（曲线1），PHIMC/GCE（曲线2），ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上的电化学行为，如图5所示.
图5（a）为800 umol·L-1AA，50 umol·L-lDA和50 umol·L-1UA的混合溶液在裸GCE（曲线1），PHIMC/GCE（曲线2），ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上的CV图，由图5（a）中曲线1和3可知，AA，DA和UA在GCE上的氧化峰幾乎重叠在一起，不能将三者区分开来.在ZnO/GCE上，AA和DA的氧化峰重叠在一起，UA的氧化峰呈现扁平状.而从曲线2和4可以看出，在PHIMC/GCE和PHIMC-ZnO/GCE上，其重叠的氧化峰均被分成3个独立的氧化峰，此外，与在PHIMC/GCE上的氧化峰相比，AA，DA和UA在PHIMC-ZnO/GCE上具有更强的峰电流响应.值得注意的是，PHIMC膜对AA和DA的重叠氧化峰有较好的区分作用，而Zn0膜对AA，DA和UA有较好的催化氧化作用，两者的协同作用使得PHIMC-ZnO/GCE不仅能很好地将AA，DA和UA的氧化峰区分开来，而且能使其氧化电流大大增加.在PHIMC-ZnO/GCE（曲线5）上，AA，DA和UA的氧化峰电位分别为0.02，0.13和0.27 V，氧化电流值为
21.2，19.0和17.3 uA.以上结果表明，该修饰电极可用于混合液中AA，DA和UA的选择性测定和同时测定，
图5（b）为800 umol·L-lAA，50 umoI ·L-1DA和50 umol·L-1UA的混合溶液在裸GCE（曲线1），PHIMC/CCE（曲线2），ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上的DPV图.由图5（b）可以看出，AA和DA在GCE（曲线1）上的氧化峰几乎重叠，UA的氧化峰呈扁平状.在PHIMC/GCE（曲线2）上，三者氧化峰的电位分别为0.02，0.19和0.33 V.在ZnO/GCE（曲线3）上，AA和DA呈现出一个重叠的宽氧化峰.在PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上，AA，DA和UA分别在0.叭，0.15和0.29 V呈现出3个独立的强氧化峰，AA-DA和DA-UA的峰电位差（△Epa）为0.14 V，峰电流分别为24.9，26.9及19.7 uA.AA，DA和UA氧化峰之间宽的峰电位差和灵敏的电流响应表明该电极可用于混合液中三者的选择性和同时测定.
2.4介质酸度的选择
介质酸度对AA，DA和UA的电化学行为有较大的影响，为此考察了不同酸度介质下AA，DA和UA的电化学行为.图6为PHIMC-ZnO/GCE在不同酸度（pH值分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.O，9.0）的0.1 mol·L-1 PBS中对AA，DA和UA的电化学响应.由图6可知，随着介质pH的增加，AA，DA和UA的氧化峰电位均逐渐负移，说明质子参与了电极反应.由图6（a）可知，当介质pH值从4.0增至6.0时，AA的峰流值逐渐增加并达到最大值，此后随着溶液pH的继续增大，AA的氧化峰电流又逐渐减弱.从图6（b）可以看出，随着介质pH值从4.0增至7.0，DA的峰电流值逐渐增加并达到最大值;当溶液pH值为7.0时，DA的氧化峰电流达到最大值，此后随着溶液pH值的继续增大，DA的氧化峰电流又下降.从图6（c）可以看出，随着溶液pH值的增大，UA的峰电流值在pH值为7.0时达到最大值，此后随着溶液pH值的继续增大，UA的氧化峰电流又逐渐减弱.基于此，为了获得高区分度和高灵敏度，本实验选用0.1 moI·L-1 pH值为7.O的PBS作为测定介质.
2.5 AA，DA和UA在PHIMC-ZnO/GCE上的选择性测定
为了考察共存于同一混合液中的AA，DA和UA在电化学选择性测定时相互之间的影响，分别在保持溶液中其他两种待测物浓度不变的情况下，研究不同浓度的另一种物质在修饰电极上的电化学行为.结果显示，若保持DA（20 umol·L-1）和UA（40 umol·L-1）的浓度不变，在一定范围内增加AA的浓度，AA的峰电流随其物质的量的浓度增加而线性增加，而DA和UA的峰电流几乎保持不变，如图7（a）所示，在220～1 200 umol·L-1范围内，AA的峰电流（ip，AA）与其物质的量浓度（cAA）呈线性关系，回归方程为ipa，AA=6.711+0.OllcAA（ r=0.997 6）.同样，若保持AA（ 800 umoI·L-l）和UA（50 umol·L-1）的浓度不变，在一定范围内增加DA的浓度，DA的峰电流也随其物质的量的浓度增加而线性增加，而AA和UA的峰电流几乎保持不变，如图7（b）所示，在5—85 umol·L-1范围内，DA的峰电流（ipa，DA）与其物质的量浓度（cDA）呈线性关系，回归方程为ipa，DA=10.331+0.187cDA（r=0.998 1）.若保持AA（800 umoI·L-l）和DA（30umol·L-1）的浓度不变，在一定范围内增加UA的浓度，UA的峰电流也随其物质的量的浓度增加而线性增加，而AA和DA的峰电流几乎保持不变，如图7（c）所示，在10—170 umol·L-l浓度范围内，UA的峰电流（ipa，UA）与其物质的量的浓度（cUA）的线性方程为ipa，UA=6.597+0.130cUA（r=0.998 5）.这表明在AA，DA和UA共存的混合液中，其他两种物质的存在不会干扰另外一种物质的响应，因此，PHIMC-ZnO/GCE可用于混合液中AA，DA和UA的选择性测定.
2.6 AA，DA和UA在PHIMC-ZnO/GCE上的同时测定 在pH值为7.0的0.1 mol.L-l的PBS中，不同物质的量浓度的AA，DA和UA的混合液在PHIMC-ZnO/GCE上的DPV图，如图8所示.由图8可知，AA，DA和UA的氧化峰电流在一定范围内均随其物质的量浓度的增加而线性增大，浓度范围分别为80.00—l 400.00， 0.15—45.00和2.00—120.00 umoI·L-1，回归方程分别为ipa，AA=4.271+0.012cAA（r=0.998 0），ipa，DA=6.182+0.301eDA（r=0.993 7）和ipa，UA=4.796+0.151cUA（r=0.998 3）.AA，DA和UA的检出限（S/N=3）分别为0.50，0.03和0.09 umoI·L-l.相比于表1中列出的同時测定AA，DA和UA的其他研究，本方法具有较低的检出限、较好的选择性和较宽的检测范围等优点.
2.7 AA，DA和UA在不同扫速下的电化学行为
在不同扫速下，PHIMC-ZnO/GCE在AA（1 600 umol·L-1），DA（200 umol·L-l）和UA（400 umol·L-l）溶液的CV图，如图9所示.由图9可知，当扫速（V）在60—260 mV ·s-1时，AA的氧化峰电流（ipa，AA）随扫速（V）的增大而线性增大，回归方程为ipa，AA=0.069 3v+7.54（r=0.998 3），表明AA在PHIMC-ZnO/GCE上的电极反应为吸附控制过程，当扫速在50—280 mV·s-1时，DA的氧化峰电流（ipa，AA）随扫速（V）的增大而线性增大，回归方程为ipa，DA=0.118 6v+6.43（r=0.998 5），表明DA在PHIMC-ZnO/GCE上的电极反应受吸附过程控制.当扫速在70—440 mV·s-1时，UA的氧化峰电流（ipa，AA）随扫速（V）的增大而线性增大，回归方程为ipa，AA= 0.049 3v+27.01（r=0.999 3），表明UA在PHIMC-ZnO/GCE上的电极反应受吸附过程控制.
2.8干扰研究
为了考察修饰电极在实际样品分析中的应用，研究了生物样品中潜在的干扰物质对AA，DA和UA测定的干扰.在含有180umoI·L-1 AA，30umol·L-l DA和50umoI·L-1 UA的PBS溶液中（pH值为7.0，0.1 mol·L-l），当相对误差在+5%范围时，分别加入柠檬酸（3 000umol.L-l），Na+（2 000 p，mol.L。1），K+（2 000 umol·L-1），Ca2+（2 200 umol·L-1），Mg2+（2 200 umol·L-1），Zn2+（2 000 umol·L-1），葡萄糖（2 000umol.L-l），L-赖氨酸（1 200 umoI·L-l），L-酪氨酸（1 200umoI·L-l），L-半胱氨酸（1 000 umol·L-l）等干扰物质对AA，DA和UA进行测定，发现均无干扰，说明该修饰电极有较好的抗干扰能力.
2.9 电极的重现性与稳定性
采用同样的方式重复测定含有180 umol·L-1 AA，30 umol·L-1 DA和50 umol·L-1 UA混合液，考察了PHIMC-ZnO/GCE的重现性和稳定性.用同一根电极连续15次测定AA，DA和UA结果的相对标准偏差（ RSD）分别为4.3%，3.3%和3.1%.另外，用5根采用相同方法制备的修饰电极对含有混合液进行测量，AA，DA和UA的RSD分别为3.7%，3.1%和2.9%，也表明修饰电极有较好的重现性.测定结束后，将修饰电极在室温下保存于pH值为7.0的0.1 mol·L-1 PBS溶液中，其峰电流在一周内基本不变，两周后下降约3.7%，一个月后下降约6.5%，表明该修饰电极具有较好的稳定性.
2.10样品分析
为了研究该修饰电极在实际样品分析中的实用性，对人体尿液和血清样本中的AA，DA和UA进行了分析.所用样本在检测前用pH值为7.0的0.1 moI·L-1 PBS溶液进行稀释，为了验证该方法的有效性，采用标准加入法在尿样和血清样本中加入一定量的AA，DA和UA标准溶液，测定AA，DA和UA的含量，结果见表2.由表2可知：AA，DA和UA的回收率分别为97.6%-104.0%，92.2%-99.O%和105.3%-108.7%，表明PHIMC-ZnO/GCE能有效地应用于实际样品中AA，DA和UA的同时测定.3结论
采用电聚合法在Zn0滴涂的GCE上聚合修饰HIMC，制得了PHIMC-Zn0复合膜修饰的GCE（ PHIMC-ZnO/GCE），并采用CV法和DPV法研究了AA，DA和UA在PHIMC-ZnO/GCE上的电化学行为.结果表明：该修饰电极不仅能够使AA，DA和UA的氧化过电位发生较大的负移和阳极峰电流增加，而且还能将它们在裸电极上重叠的弱氧化峰分开成3个明显的强氧化峰，并有较大的峰间距.因此，PHIMC-ZnO/GCE可用于混合液中AA，DA和UA的同时测定，并有较好的灵敏度、选择性和较高的电催化行为.将该方法用于尿液和血清中AA，DA和UA的同时测定，结果令人满意，
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（責任编辑：郁慧，冯珍珍）
收稿日期：2019-11-12
基金项目：上海市教委重点课程建设项目（A-0131-18-004031）;全国青年教师教育教学研究课题（2017QNJ079）
作者简介：赵丹（1993-），女，硕士研究生，主要从事电分析化学方面的研究.E-mail：zhaodan6728@163.com
通信作者：张雷（1968-），男，副教授，主要从事导电高聚物、生物传感器及光谱电化学方面的研究.E-mail：chemzl@shnu.edu.cn
引用格式：赵丹，张雷.聚1H-咪唑-4-甲酸一纳米氧化锌复合膜修饰电极的制备及其对抗坏血酸、多巴胺和尿酸的同时测定[J].上海师范大学学报（自然科学版），2020，49（2）：191-202.
关键词：1H-咪唑-4-甲酸（HIMC）;纳米氧化锌（Zn0）;抗坏血酸（AA）;多巴胺（DA）;尿酸（UA）
中图分类号：0 657.1
文献标志码：A
文章编号：1000-5137（2020）02-0191-12
0引 言
抗坏血酸（AA）又叫维生素C，是维持人体健康必需的一种水溶性维生素，在体内生物合成及物质代谢中发挥重要作用[1-2]，人体中AA含量不足会引发坏血病、牙龈出血和牙齿脱落等疾病[3-4]，因此对AA的定量分析在食品和医药等领域相当重要.多巴胺（DA）是哺乳类动物中枢神经系统中重要的神经递质[5]，人体内DA含量失调会引发心脏病、帕金森病等疾病6-7J.此外，DA类物质还具有兴奋心脏、增加肾血流量的作用，可用于治疗心肌梗死、肾功能衰竭等引起的休克综合征[8].因此，DA浓度的准确测定对于神经生理学研究、疾病诊断及相关药物的质量控制也尤为重要.尿酸（UA）是人体中嘌呤的最终代谢产物[9]，是尿液和血液中的一种重要物质.人体内UA含量异常时会导致糖尿病、痛风、白血病和高血压等疾病[10]，因此，对人体中AA，DA和UA含量的测定具有医学和生命科学意义.
目前，对于AA，DA和UA等生物分子的检测主要采用化学发光法[11]、高效液相色谱法[12]、毛细管电泳法[13]及电化学方法[14-15]等.在这些方法中，电化学方法因操作简单、成本低廉、灵敏度高等优点而被广泛关注.然而，由于AA，DA和UA共存于生物体液中，且三者在裸电极上具有较高的相互接近的氧化过电位，因此很难对三者进行同时测定.基于此，本文作者首先采用滴涂法將纳米氧化锌（Zn0）修饰在玻碳电极（GCE）上制备纳米Zn0修饰的GCE （ZnO/GCE），然后在ZnO/GCE上电聚合1H-咪唑-4-甲酸（ HIMC）制得聚1H-咪唑-4-甲酸一纳米ZnO（PHIMC-Zn0）复合膜修饰的GCE（ PHIMC-ZnO/GCE）.该复合膜能有效结合HIMC的电化学活性和纳米Zn0良好的生物相容性及高的电子传递特性，使其呈现出独特的性质[16]，将该PHIMC-ZnO/GCE应用于尿样和血清中AA，DA和UA的同时检测，结果令人满意.
1实验部分
1.1仪器与试剂
PCSTAT128N型AUTOLAB电化学工作站，瑞士万通;雷磁pHS-25型精密pH计，上海精密科学仪器有限公司;SJ-1200型超声波清洗器，上海洁净超声波设备厂;三电极体系：表面修饰玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极（ SCE）为参比电极，盘状铂丝电极为辅助电极;S-4800场发射扫描电子显微镜（SEM），日本日立;差分脉冲伏安法（DPV）实验的测试电位范围为-0.2-0.8 V，扫速为0.05 V·s-l，脉冲幅度为0.025 V·s-1，频率为0.5 s，脉冲宽度为0.06 s，所有电化学测试均在室温（20+3）℃下完成，溶液和电极保持静止;电化学阻抗（ EIS）测量均在含1 mmol·L-1K，Fe（CN）6，1 mmol·L-1K4Fe（CN）6及0.1 moI.L_lKNO3的混合液中进行，开路电位为0.19 V，频率范围为0.01-100 kHz.
HIMC，Aladdin;Zn0，上海笛柏化学品技术有限公司;AA，上海曹杨二中化工厂;DA，Sigma;UA，Sigma;磷酸盐缓冲溶液（PBS），pH值为4.0—9.0，由0.1 mol·L-1的NaH2PO4和Na2HPO4溶液配制;其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水.
1.2修饰电极的制备
PHIMC-ZnO/GCE的制备：称取8 mg纳米Zn0分散在10 mL超纯水中并超声5 min，配制Zn0分散液.在进行表面修饰之前，将GCE依次用0.3 um和0.05 um的氧化铝（Al202）粉抛光至镜面，用蒸馏水冲洗后，依次在无水乙醇和蒸馏水中各超声清洗2 min，高纯氮气（N2）吹干，室温保存，取6uL Zn0分散液滴于GCE表面，室温下晾干，然后在含有0.01 mol.L-l HIMC的0.1 mol·L-1H2SO4溶液中，对制得PHIMC -ZnO/GCE用循环伏安法（CV）在-0.6+1.8V电位范围内以0.05 V·s-1的扫速循环扫描15圈.修饰电极置于0.1 mol·L-l pH值为7.0的PBS溶液中室温保存、备用，
聚1H-咪唑-4-甲酸修饰的GCE（ PHIMC/GCE）的制备：将GCE置于含有0.01 mol·L-1 HIMC的0.1mol·L-l H2SO4溶液中，用循环伏安法在-0.6 +1.8 V电位范围内以0.05 V·s-1的扫速循环扫描15圈制得PHIMC/GCE. ZnO/GCE的制备：将6uL Zn0分散液滴涂到GCE表面，室温下晾干即可制得ZnO/GCE.
2结果与讨论
2.1修饰电极的制备与表征
2.1.1
HIMC在ZnO/GCE上的电化学聚合
图l为ZnO/GCE在含有0.01 mol·L-1 HIMC的0.1 mol·L-lH2SO4溶液中电聚合15圈后的CV图.由图l中内插图（b）可以看出，在扫描的第一圈，出现了1个峰电位位于1.09 V的氧化峰和2个分别位于-0.37 V和0.61 V微弱的还原峰.其中，峰电位位于1.09 V的氧化峰归因于HIMC失去1个e发生氧化反应生成1H-咪唑-4-甲酸自由基（HIMC+）;位于-0.37 V和0.61 V的还原峰为HIMC+与其单体或HIMC+之间发生化学反应生成的1H-咪唑-4-甲酸二聚体或低聚物的还原所致.
随着扫描的持续进行，位于1.09 V的氧化峰逐渐减弱消失，而在1.55 V处出现了一个新的微弱的氧化峰.这是由于在第1圈中生成的HIMC+与其单体或HIMC+之间发生化学反应生成的HIMC的二聚体或低聚物的再氧化所致.随着反应的持续进行，溶液中HIMC的浓度逐渐减小，电极表面发生电氧化的HIMC的分子数也不断减少，从而导致位于1.09 V处的氧化峰逐渐减弱，直至消失;随着扫描圈数的增加，位于1.55 V处的氧化峰和位于-0.37 V和0.61 V的还原峰的峰电流逐渐增大，直至基本稳定.这些电化学行为表明PHIMC在ZnO/GCE上的形成，且在15圈后基本稳定.
2.1.2修饰电极的表面形貌
图2（a），2（b）和2（c）分别为PHIMC/GCE，ZnO/GCE和PHIMC-ZnO/GCE的SEM图，由图2可知，PHIMC/GCE，ZnO/GCE和PHIMC-ZnO/CCE表面分别呈现出不同的结构形貌.其中，图2（a）中PHIMC膜呈现出“方糖”状的块状结构，颗粒的直径约为10～40um;图2（b）中的ZnO/CCE表面呈现出“棒一块”状交替的非均匀结构，直径约为30～100 nm，长度约为1～5 um;图2（c）显示，当在ZnO/GCE上进一步修饰PHIMC后，在电极表面形成了一层紧致复合膜，这种复合膜结构为生物分子的负载及其电催化氧化提供了良好的活性平台.
2.1.3 EIS表征
EIS是用于测试电极界面动力学屏障的工具，常用来研究在改性过程中电极表面的阻抗变化.EIS谱包括一个位于高频区的半圆部分和一个位于低频区的直线部分，高频区的半圆部分对应电子传递受限过程，低频区的直线部分对应电子传递扩散过程.为了进一步考察各聚合物膜在电极表面的导电性，分别对GCE（曲线a），PHIMC/GCE（曲线b），PHIMC-ZnO/GCE（曲线c）和ZnO/GCE（内插图）在等物质的量浓度的Fe（CN）63-/4-溶液中的EIS谱进行了研究，如图3所示，
由图3可知，GCE的电荷交换电阻（Ret）約为1470 Ω（曲线a）;当在GCE表面修饰PHIMC膜时，其Ret值增加到约4 340Ω（曲线b），表明PHIMC膜对电子传递有阻碍作用;当在GCE表面修饰Zn0膜时，其Ret值降低到约1149 Q（内插图曲线d），表明纳米Zn0具有较高的电子传递特性，促进了电极的电子传递速率;当在GCE表面修饰PHIMC-Zn0复合膜后，它的Ret值显著降低到约1270Ω（曲线c），表明复合膜能有效地促进了电极表面电子的传递，同时也表明了PHIMC-Zn0复合膜已修饰到电极表面.
2.2 AA，DA和UA在修饰电极上的电化学氧化
为了研究AA，DA和UA在修饰电极上的电化学行为，图4（a），4（b）和4（c）分别展示了1 000 umol·L-lAA，130 umol·L-1 DA和180 umol·L-l UA在GCE（曲线1）、PHIMC/GCE（曲线2）、ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上的伏安响应.
从图4（a）可以看出，在GCE（曲线1）上，AA呈现出一个位于0.12 V处宽的弱氧化峰;在PHIMC/GCE（曲线2）上，AA的氧化峰电位为0.09 V.与裸GCE相比，AA在PHIMC/GCE上不仅具有较低的氧化过电位，且其氧化峰电流是裸GCE上峰电流的2.6倍;在ZnO/GCE（曲线3）上，AA具有比其在PHIMC/GCE上更低的氧化峰电位（0.07 V）;在PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上，AA的氧化峰电位为0.08 V.与裸GCE相比，AA在PHIMC-ZnO/GCE上不仅具有较低的氧化过电位，而且其氧化峰电流也大大增加，为其在裸GCE上峰电流值的3.5倍.由此可知，与裸GCE相比，AA在PHIMC/GCE，ZnO/GCE和PHIMC-ZnO/GCE上都有较低的氧化过电位和较强的峰电流响应，表明此3种修饰电极对AA的电化学氧化都具有催化作用，而其中催化作用最为显著的为复合膜修饰的PHIMC-ZnO/GCE电极.
从图4（b）可以看出，在GCE（曲线1）上，DA在0.22 V处呈现出一个很宽的弱氧化峰，而在PHIMC/GCE（曲线2），ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上，DA的氧化过电位均负移，分别为0.17，0.15及0.16 V，且峰电流均增大，分别为DA在GCE上峰电流的2.0，2.5及3.0倍，其中表现最为突出的为PHIMC-ZnO/GCE.在该复合膜修饰的GCE上，DA的氧化峰负移到0.16V处，较裸GCE减小0.06V，且峰电流为其在裸GCE上的3.0倍，这说明PHIMC-ZnO/GCE对DA有较好的催化氧化作用.
从图4（c）可以看出，在GCE（曲线1）上，UA在0.34 V处呈现出一个很宽的弱氧化峰，而在PHIMC/GCE（曲线2），ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上，UA的氧化过电位均负移，分别为0.28，0.32及0.27 V，且峰电流均增大，分别为UA在GCE上峰电流的5.9，3.1及8.5倍.由此可见，这3种修饰电极对UA的电化学氧化都具有催化作用，其中PHIMC-ZnO/GCE对UA的催化氧化作用最为突出. 2.3 PHIMC-ZnO/GCE对混合液中AA，DA和UA的电化学区分
为了考察PHIMC-ZnO/GCE的实用性，分别采用CV法和DPV法研究了AA，DA和UA的混合液在GCE（曲线1），PHIMC/GCE（曲线2），ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上的电化学行为，如图5所示.
图5（a）为800 umol·L-1AA，50 umol·L-lDA和50 umol·L-1UA的混合溶液在裸GCE（曲线1），PHIMC/GCE（曲线2），ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上的CV图，由图5（a）中曲线1和3可知，AA，DA和UA在GCE上的氧化峰幾乎重叠在一起，不能将三者区分开来.在ZnO/GCE上，AA和DA的氧化峰重叠在一起，UA的氧化峰呈现扁平状.而从曲线2和4可以看出，在PHIMC/GCE和PHIMC-ZnO/GCE上，其重叠的氧化峰均被分成3个独立的氧化峰，此外，与在PHIMC/GCE上的氧化峰相比，AA，DA和UA在PHIMC-ZnO/GCE上具有更强的峰电流响应.值得注意的是，PHIMC膜对AA和DA的重叠氧化峰有较好的区分作用，而Zn0膜对AA，DA和UA有较好的催化氧化作用，两者的协同作用使得PHIMC-ZnO/GCE不仅能很好地将AA，DA和UA的氧化峰区分开来，而且能使其氧化电流大大增加.在PHIMC-ZnO/GCE（曲线5）上，AA，DA和UA的氧化峰电位分别为0.02，0.13和0.27 V，氧化电流值为
21.2，19.0和17.3 uA.以上结果表明，该修饰电极可用于混合液中AA，DA和UA的选择性测定和同时测定，
图5（b）为800 umol·L-lAA，50 umoI ·L-1DA和50 umol·L-1UA的混合溶液在裸GCE（曲线1），PHIMC/CCE（曲线2），ZnO/GCE（曲线3）和PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上的DPV图.由图5（b）可以看出，AA和DA在GCE（曲线1）上的氧化峰几乎重叠，UA的氧化峰呈扁平状.在PHIMC/GCE（曲线2）上，三者氧化峰的电位分别为0.02，0.19和0.33 V.在ZnO/GCE（曲线3）上，AA和DA呈现出一个重叠的宽氧化峰.在PHIMC-ZnO/GCE（曲线4）上，AA，DA和UA分别在0.叭，0.15和0.29 V呈现出3个独立的强氧化峰，AA-DA和DA-UA的峰电位差（△Epa）为0.14 V，峰电流分别为24.9，26.9及19.7 uA.AA，DA和UA氧化峰之间宽的峰电位差和灵敏的电流响应表明该电极可用于混合液中三者的选择性和同时测定.
2.4介质酸度的选择
介质酸度对AA，DA和UA的电化学行为有较大的影响，为此考察了不同酸度介质下AA，DA和UA的电化学行为.图6为PHIMC-ZnO/GCE在不同酸度（pH值分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.O，9.0）的0.1 mol·L-1 PBS中对AA，DA和UA的电化学响应.由图6可知，随着介质pH的增加，AA，DA和UA的氧化峰电位均逐渐负移，说明质子参与了电极反应.由图6（a）可知，当介质pH值从4.0增至6.0时，AA的峰流值逐渐增加并达到最大值，此后随着溶液pH的继续增大，AA的氧化峰电流又逐渐减弱.从图6（b）可以看出，随着介质pH值从4.0增至7.0，DA的峰电流值逐渐增加并达到最大值;当溶液pH值为7.0时，DA的氧化峰电流达到最大值，此后随着溶液pH值的继续增大，DA的氧化峰电流又下降.从图6（c）可以看出，随着溶液pH值的增大，UA的峰电流值在pH值为7.0时达到最大值，此后随着溶液pH值的继续增大，UA的氧化峰电流又逐渐减弱.基于此，为了获得高区分度和高灵敏度，本实验选用0.1 moI·L-1 pH值为7.O的PBS作为测定介质.
2.5 AA，DA和UA在PHIMC-ZnO/GCE上的选择性测定
为了考察共存于同一混合液中的AA，DA和UA在电化学选择性测定时相互之间的影响，分别在保持溶液中其他两种待测物浓度不变的情况下，研究不同浓度的另一种物质在修饰电极上的电化学行为.结果显示，若保持DA（20 umol·L-1）和UA（40 umol·L-1）的浓度不变，在一定范围内增加AA的浓度，AA的峰电流随其物质的量的浓度增加而线性增加，而DA和UA的峰电流几乎保持不变，如图7（a）所示，在220～1 200 umol·L-1范围内，AA的峰电流（ip，AA）与其物质的量浓度（cAA）呈线性关系，回归方程为ipa，AA=6.711+0.OllcAA（ r=0.997 6）.同样，若保持AA（ 800 umoI·L-l）和UA（50 umol·L-1）的浓度不变，在一定范围内增加DA的浓度，DA的峰电流也随其物质的量的浓度增加而线性增加，而AA和UA的峰电流几乎保持不变，如图7（b）所示，在5—85 umol·L-1范围内，DA的峰电流（ipa，DA）与其物质的量浓度（cDA）呈线性关系，回归方程为ipa，DA=10.331+0.187cDA（r=0.998 1）.若保持AA（800 umoI·L-l）和DA（30umol·L-1）的浓度不变，在一定范围内增加UA的浓度，UA的峰电流也随其物质的量的浓度增加而线性增加，而AA和DA的峰电流几乎保持不变，如图7（c）所示，在10—170 umol·L-l浓度范围内，UA的峰电流（ipa，UA）与其物质的量的浓度（cUA）的线性方程为ipa，UA=6.597+0.130cUA（r=0.998 5）.这表明在AA，DA和UA共存的混合液中，其他两种物质的存在不会干扰另外一种物质的响应，因此，PHIMC-ZnO/GCE可用于混合液中AA，DA和UA的选择性测定.
2.6 AA，DA和UA在PHIMC-ZnO/GCE上的同时测定 在pH值为7.0的0.1 mol.L-l的PBS中，不同物质的量浓度的AA，DA和UA的混合液在PHIMC-ZnO/GCE上的DPV图，如图8所示.由图8可知，AA，DA和UA的氧化峰电流在一定范围内均随其物质的量浓度的增加而线性增大，浓度范围分别为80.00—l 400.00， 0.15—45.00和2.00—120.00 umoI·L-1，回归方程分别为ipa，AA=4.271+0.012cAA（r=0.998 0），ipa，DA=6.182+0.301eDA（r=0.993 7）和ipa，UA=4.796+0.151cUA（r=0.998 3）.AA，DA和UA的检出限（S/N=3）分别为0.50，0.03和0.09 umoI·L-l.相比于表1中列出的同時测定AA，DA和UA的其他研究，本方法具有较低的检出限、较好的选择性和较宽的检测范围等优点.
2.7 AA，DA和UA在不同扫速下的电化学行为
在不同扫速下，PHIMC-ZnO/GCE在AA（1 600 umol·L-1），DA（200 umol·L-l）和UA（400 umol·L-l）溶液的CV图，如图9所示.由图9可知，当扫速（V）在60—260 mV ·s-1时，AA的氧化峰电流（ipa，AA）随扫速（V）的增大而线性增大，回归方程为ipa，AA=0.069 3v+7.54（r=0.998 3），表明AA在PHIMC-ZnO/GCE上的电极反应为吸附控制过程，当扫速在50—280 mV·s-1时，DA的氧化峰电流（ipa，AA）随扫速（V）的增大而线性增大，回归方程为ipa，DA=0.118 6v+6.43（r=0.998 5），表明DA在PHIMC-ZnO/GCE上的电极反应受吸附过程控制.当扫速在70—440 mV·s-1时，UA的氧化峰电流（ipa，AA）随扫速（V）的增大而线性增大，回归方程为ipa，AA= 0.049 3v+27.01（r=0.999 3），表明UA在PHIMC-ZnO/GCE上的电极反应受吸附过程控制.
2.8干扰研究
为了考察修饰电极在实际样品分析中的应用，研究了生物样品中潜在的干扰物质对AA，DA和UA测定的干扰.在含有180umoI·L-1 AA，30umol·L-l DA和50umoI·L-1 UA的PBS溶液中（pH值为7.0，0.1 mol·L-l），当相对误差在+5%范围时，分别加入柠檬酸（3 000umol.L-l），Na+（2 000 p，mol.L。1），K+（2 000 umol·L-1），Ca2+（2 200 umol·L-1），Mg2+（2 200 umol·L-1），Zn2+（2 000 umol·L-1），葡萄糖（2 000umol.L-l），L-赖氨酸（1 200 umoI·L-l），L-酪氨酸（1 200umoI·L-l），L-半胱氨酸（1 000 umol·L-l）等干扰物质对AA，DA和UA进行测定，发现均无干扰，说明该修饰电极有较好的抗干扰能力.
2.9 电极的重现性与稳定性
采用同样的方式重复测定含有180 umol·L-1 AA，30 umol·L-1 DA和50 umol·L-1 UA混合液，考察了PHIMC-ZnO/GCE的重现性和稳定性.用同一根电极连续15次测定AA，DA和UA结果的相对标准偏差（ RSD）分别为4.3%，3.3%和3.1%.另外，用5根采用相同方法制备的修饰电极对含有混合液进行测量，AA，DA和UA的RSD分别为3.7%，3.1%和2.9%，也表明修饰电极有较好的重现性.测定结束后，将修饰电极在室温下保存于pH值为7.0的0.1 mol·L-1 PBS溶液中，其峰电流在一周内基本不变，两周后下降约3.7%，一个月后下降约6.5%，表明该修饰电极具有较好的稳定性.
2.10样品分析
为了研究该修饰电极在实际样品分析中的实用性，对人体尿液和血清样本中的AA，DA和UA进行了分析.所用样本在检测前用pH值为7.0的0.1 moI·L-1 PBS溶液进行稀释，为了验证该方法的有效性，采用标准加入法在尿样和血清样本中加入一定量的AA，DA和UA标准溶液，测定AA，DA和UA的含量，结果见表2.由表2可知：AA，DA和UA的回收率分别为97.6%-104.0%，92.2%-99.O%和105.3%-108.7%，表明PHIMC-ZnO/GCE能有效地应用于实际样品中AA，DA和UA的同时测定.3结论
采用电聚合法在Zn0滴涂的GCE上聚合修饰HIMC，制得了PHIMC-Zn0复合膜修饰的GCE（ PHIMC-ZnO/GCE），并采用CV法和DPV法研究了AA，DA和UA在PHIMC-ZnO/GCE上的电化学行为.结果表明：该修饰电极不仅能够使AA，DA和UA的氧化过电位发生较大的负移和阳极峰电流增加，而且还能将它们在裸电极上重叠的弱氧化峰分开成3个明显的强氧化峰，并有较大的峰间距.因此，PHIMC-ZnO/GCE可用于混合液中AA，DA和UA的同时测定，并有较好的灵敏度、选择性和较高的电催化行为.将该方法用于尿液和血清中AA，DA和UA的同时测定，结果令人满意，
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（責任编辑：郁慧，冯珍珍）
收稿日期：2019-11-12
基金项目：上海市教委重点课程建设项目（A-0131-18-004031）;全国青年教师教育教学研究课题（2017QNJ079）
作者简介：赵丹（1993-），女，硕士研究生，主要从事电分析化学方面的研究.E-mail：zhaodan6728@163.com
通信作者：张雷（1968-），男，副教授，主要从事导电高聚物、生物传感器及光谱电化学方面的研究.E-mail：chemzl@shnu.edu.cn
引用格式：赵丹，张雷.聚1H-咪唑-4-甲酸一纳米氧化锌复合膜修饰电极的制备及其对抗坏血酸、多巴胺和尿酸的同时测定[J].上海师范大学学报（自然科学版），2020，49（2）：191-202.