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摘要： 铁皮石斛是我国传统名贵药材，近些年，随着分子生物学技术的进步，铁皮石斛在分子方面的研究快速发展，在分子鉴定、遗传多样性、功能基因克隆分析等方面并取得了一定进展。通过查阅相关文献，综述铁皮石斛功能基因在生长发育调控、次生代谢产物合成和抗环境胁迫三个方面的研究进展，以期为该领域的进一步研究及铁皮石斛的科学、有效、合理利用提供理论依据。
关键词： 铁皮石斛;功能基因
中图分类号：R282 文献标志码：B 文章编号：1007-2349（2021）08-0088-03
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）系兰科石斛属多年生植物，为我国传统名贵药材，以新鲜或干燥的茎入药，在《神农本草经》和《本草纲目》中均被列为上品，具有滋阴清热、养阴生津、温胃明目、补肾益力等功效。
目前，铁皮石斛已经在种质资源[1]、化学成分及药理作用[2-4]、组织培养[5]、质量控制[6]等研究方面取得了丰硕成果。近些年，随着分子生物学技术的进步，铁皮石斛在分子方面的研究快速发展，在分子鉴定、遗传多样性、功能基因克隆分析等方面并取得了一定进展。
铁皮石斛功能基因研究主要集中在3个方面：生长发育调控功能基因、次生代谢产物合成功能基因和抗环境胁迫功能基因。笔者从这三个方面对近年来铁皮石斛功能基因研究进展进行归纳和总结，以期为该领域的进一步研究及铁皮石斛的科学、有效、合理利用提供理论依据。
1 铁皮石斛生长发育调控功能基因研究
蛋白质可逆磷酸化是真核生物体调节细胞周期的基础机制，而蛋白激酶（protein kinases，PK）和蛋白磷酸酶（protein phosphatase，PP）是蛋白质可逆磷酸化的关键调控酶，在植物体的信号转导途径和生理代谢过程中起重要调节作用。刘亮亮等[7]通过对铁皮石斛蛋白磷酸酶2A基因（PP2A）进行催化亚基基因克隆、生物信息学、表达模式等研究，发现DoPP2A在根中发挥一定生理作用。张娜等[8]的研究发现DoPP2C1基因具有组织表达特异性，其转录本在石斛根和茎中表达量较高，推测该基因通过特异的分子表达机制参与植物组织的生长发育。
ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporters）是一类普遍存在于原核生物和真核生物中的跨膜转运蛋白，其转运功能强大，参与植物激素、金属离子、脂质、次生代谢物和外源物质的运输密切相关[9]。李依民等[10]研究發现2个F家族ABC转运蛋白基因在石斛叶中表达丰度较高，推测其可能在叶片中发挥一定的生物学功能。阎波等[11]初步鉴定了ABCA-ABCI等7个亚家族的88个铁皮石斛ABC转运蛋白，这些蛋白主要定位在细胞质膜、液泡及高尔基体上。其中，ABCB和ABCG蛋白家族部分成员在种子接菌共生萌发过程中显著差异上调表达，预测这些蛋白在铁皮石斛种子萌发及与微生物相互作用过程中发挥重要作用。
李欢等[12]用铁皮石斛过氧化氢酶基因DoCAT1cDNA进行生物信息和表达分析，实验qPCR表达分析显示，DoCAT1在植物器官中的表达存在显著的差异，根中具有高表达特征，推测该基因可能参与植物石斛根的生长发育调控或生理响应过程。
范静等[13]通过克隆铁皮石斛硫氧还蛋白超家族基因（Thiore-doxin like 2，DoTrxL2）进行研究，发现DoTrxL2在铁皮石斛原球茎形成早期表达量较高，表明该基因对原球茎形成有促进作用;而在种子和花中表达量高，表明该基因对植物组织的生殖发育具有调控作用。
张岗等[14]从铁皮石斛中克隆得到转录因子基因DoWRKY3，该基因具有组织表达特异性，在铁皮石斛根和叶中相对表达量较高。
李依民等[15]从铁皮石斛中克隆到4个CIPK基因cDNA全长，研究表明4个CIPKs基因是铁皮石斛中新鉴定的类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶编码基因，推测这4个基因通过不同的表达和作用方式参与石斛营养器官的生长发育过程。
刘思思等[16]首次克隆得到1个赤霉素3-氧化酶基因（DoGA3ox）的全长cDNA，通过研究发现该基因在铁皮石斛种子萌发中起着重要调控作用。
2 铁皮石斛次生代谢产物合成功能基因研究
多糖是铁皮石斛的主要次生代谢产物，也是铁皮石斛的主要有效成分。宋爽[17]通过进行铁皮石斛全基因组糖基转移酶分析，克隆得到铁皮石斛β-1，3葡聚糖合成酶基因部分序列，为研究多糖代谢途径提供参考。吕楠等[18]克隆尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）基因，推测该基因与多糖累积的活跃程度成正比例。
李依民等[19]利用RACE技术首次从铁皮石斛中分离到一个己糖转运蛋白基因cDNA全长DoHT1，并发现DoHT1是编码铁皮石斛己糖转运蛋白的新基因。
苗小荣等[20]克隆铁皮石斛中性/碱性转化酶（NI）家族基因DoNI2，该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中起重要作用。
沈王琴等[21]克隆铁皮石斛倍半萜合成酶基因（DoSES），并分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及在信号分子茉莉酸甲酯（MeJA）诱导下的表达模式，为进一步研究调控铁皮石斛萜类代谢奠定了基础。
3 铁皮石斛抗环境胁迫功能基因研究
钙依赖蛋白激酶（CDPK）是一类能响应低温等非生物胁迫的蛋白激酶。盛况等[22]研究发现铁皮石斛 DoCDPK6主要在叶片中表达，其次是茎和根;在4℃低温、脱落酸和NaCl胁迫处理后，DoCDPK6基因表达量均有不同程度的上调，推测DoCDPK6基因在低温等非生物胁迫中起到调控作用。汪园等[23]采用PCR技术克隆铁皮石斛DcCDPK8基因，通过研究明确了DcCDPK8对低温和激素的响应机制。 蒋园等[24]首次从铁皮石斛中克隆到一个WRKY基因，该基因在低温胁迫、ABA胁迫和蔗糖胁迫下均被诱导表达，推测DoWRKY5基因在铁皮石斛应答低温胁迫等多种非生物胁迫中可能起重要的调控作用。
裴薇等[25]通过对铁皮石斛多聚泛素基因DoUb1的克隆及表达分析，发现该基因对低温胁迫较敏感。
凌鸿等[26]首次获得了铁皮石斛晚期胚胎富集蛋白LEA2全长 cDNA序列，并验证了其耐盐胁迫功能。
4 小结
铁皮石斛功能基因的研究起步较晚，目前相关研究报道主要围绕克隆和表达模式分析，以及少数转基因功能验证方面的工作。铁皮石斛为我国珍稀名贵药材，目前具有良好的开发潜力和应用前景，应用现代基因工程技术，从基因层面阐释铁皮石斛生长发育、活性产物代谢调控、抗环境胁迫的分子基础及相关机制，对实现铁皮石斛人工种植、良种选育和产业化发展具有重要价值。
参考文献：
[1]丁鸽，张代臻，丁小余.石斛资源分子水平研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2018，24（4）：208-215.
[2]孙恒，胡强，金航，等.铁皮石斛化学成分及药理活性研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（11）：225-234.
[3]刘敬，邓仙梅，赵斌，等.铁皮石斛药理作用研究进展[J].亚太传统医药，2017，13（15）：27-30.
[4]张雪琴，赵庭梅，刘静，等.石斛化学成分及药理作用研究进展[J].中草药，2018，49（13）：3174-3182.
[5]陈勇，刘和平，唐海尧，等.铁皮石斛的组培快繁技术研究进展[J].现代园艺，2017，（18）：9-10.
[6]张治军.药用石斛质量控制新技术研究进展[J].海峡药学，2017，29（12）：46-49.
[7]刘亮亮，张娜，黑小斌，等.铁皮石斛蛋白磷酸酶2A基因的分子克隆研究[J].上海中医药杂志，2018，52（9）：61-64+68.
[8]张娜，刘亮亮，李欢，等.铁皮石斛蛋白磷酸酶DoPP2C1基因的克隆与表达分析[J].中草药，2018，49（7）：1661-1666.
[9]曹冠华，柏旭，陈迪，等.ABC转运蛋白结构特点及在植物和真菌重金属耐性中的作用与机制[J].农业生物技术学报，2016，24（10）：1617-1628.
[10]李依民，雷根平，顏永刚，等.铁皮石斛2个F家族ABC转运蛋白基因的克隆和表达研究[J].中草药，2017，48（15）：3153-3159.
[11]阎波，刘思思，陈娟，等.药用植物铁皮石斛ABC转运蛋白基因的鉴定及其差异表达分析[J].药学学报，2018，53（7）：1177-1189.
[12]李欢，陈莹，黑小斌，等.铁皮石斛过氧化氢酶基因DoCAT1的鉴定与表达分析[J].中国药学杂志，2018，53（17）：1447-1452.
[13]范静，毛欢，刘楚琪，等.铁皮石斛硫氧还蛋白基因（DoTrxL2）的克隆及表达分析[J].生物学杂志，2018，35（5）：18-22.
[14]张岗，刘思思，彭亮，等.铁皮石斛转录因子基因DoWRKY3的克隆与分子特性分析[J].中草药，2017，48（14）：2930-2936.
[15]李依民，张娜，沈霞，等.珍稀药用铁皮石斛4个CIPKs基因的鉴定与表达分析[J].药学学报，2018，53（2）：304-312.
[16]刘思思，张岗，陈晓梅，等.铁皮石斛赤霉素3-氧化酶基因的克隆及表达分析[J].中草药，2016，47（6）：990-996.
[17]宋爽.铁皮石斛糖基转移酶基因分析及β-1，3葡聚糖合成酶基因的克隆[D].云南农业大学，2016.
[18]吕楠，安红强，裴薇，等.铁皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆与分析[J].现代生物医学进展，2017，17（7）：1215-1219+1232.
[19]李依民，陈莹，刘阿萍，等.铁皮石斛己糖转运蛋白基因DoHT1的分离和表达分析[J].中国中药杂志，2018，43（6）：1124-1130.
[20]苗小荣，牛俊奇，莫昭展，等.铁皮石斛中性/碱性转化酶（DoNI2）基因的克隆和表达分析[J].中草药，2018，49（15）：3659-3666.
[21]沈王琴，陈龙龙，张传明，等.铁皮石斛倍半萜合成酶基因的克隆与表达分析[J].中草药，2017，48（23）：4963-4969.
[22]盛况，高燕会，斯金平，等.铁皮石斛DoCDPK6基因及启动子的克隆与表达分析[J].农业生物技术学报，2017，25（4）：588-598.
[23]汪园，高燕会，朱玉球，等.铁皮石斛DcCDPK8基因启动子克隆及功能分析[J].中国中药杂志：1-8.
[24]蒋园，朱玉球，高燕会，等.铁皮石斛WRKY5基因的克隆与表达分析[J].中草药，2016，47（2）：301-308.
[25]裴薇，梁易，范静，等.铁皮石斛多聚泛素基因Polyubiquitin1（DoUb1）的克隆及表达分析[J].生物学杂志，2017，34（3）：6-10.
[26]凌鸿，曾旭，郭顺星.铁皮石斛DoLEA2基因的克隆、表达及功能分析[J].药学学报，2017，52（8）：1337-1344.
（收稿日期：2020-12-02）
关键词： 铁皮石斛;功能基因
中图分类号：R282 文献标志码：B 文章编号：1007-2349（2021）08-0088-03
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）系兰科石斛属多年生植物，为我国传统名贵药材，以新鲜或干燥的茎入药，在《神农本草经》和《本草纲目》中均被列为上品，具有滋阴清热、养阴生津、温胃明目、补肾益力等功效。
目前，铁皮石斛已经在种质资源[1]、化学成分及药理作用[2-4]、组织培养[5]、质量控制[6]等研究方面取得了丰硕成果。近些年，随着分子生物学技术的进步，铁皮石斛在分子方面的研究快速发展，在分子鉴定、遗传多样性、功能基因克隆分析等方面并取得了一定进展。
铁皮石斛功能基因研究主要集中在3个方面：生长发育调控功能基因、次生代谢产物合成功能基因和抗环境胁迫功能基因。笔者从这三个方面对近年来铁皮石斛功能基因研究进展进行归纳和总结，以期为该领域的进一步研究及铁皮石斛的科学、有效、合理利用提供理论依据。
1 铁皮石斛生长发育调控功能基因研究
蛋白质可逆磷酸化是真核生物体调节细胞周期的基础机制，而蛋白激酶（protein kinases，PK）和蛋白磷酸酶（protein phosphatase，PP）是蛋白质可逆磷酸化的关键调控酶，在植物体的信号转导途径和生理代谢过程中起重要调节作用。刘亮亮等[7]通过对铁皮石斛蛋白磷酸酶2A基因（PP2A）进行催化亚基基因克隆、生物信息学、表达模式等研究，发现DoPP2A在根中发挥一定生理作用。张娜等[8]的研究发现DoPP2C1基因具有组织表达特异性，其转录本在石斛根和茎中表达量较高，推测该基因通过特异的分子表达机制参与植物组织的生长发育。
ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporters）是一类普遍存在于原核生物和真核生物中的跨膜转运蛋白，其转运功能强大，参与植物激素、金属离子、脂质、次生代谢物和外源物质的运输密切相关[9]。李依民等[10]研究發现2个F家族ABC转运蛋白基因在石斛叶中表达丰度较高，推测其可能在叶片中发挥一定的生物学功能。阎波等[11]初步鉴定了ABCA-ABCI等7个亚家族的88个铁皮石斛ABC转运蛋白，这些蛋白主要定位在细胞质膜、液泡及高尔基体上。其中，ABCB和ABCG蛋白家族部分成员在种子接菌共生萌发过程中显著差异上调表达，预测这些蛋白在铁皮石斛种子萌发及与微生物相互作用过程中发挥重要作用。
李欢等[12]用铁皮石斛过氧化氢酶基因DoCAT1cDNA进行生物信息和表达分析，实验qPCR表达分析显示，DoCAT1在植物器官中的表达存在显著的差异，根中具有高表达特征，推测该基因可能参与植物石斛根的生长发育调控或生理响应过程。
范静等[13]通过克隆铁皮石斛硫氧还蛋白超家族基因（Thiore-doxin like 2，DoTrxL2）进行研究，发现DoTrxL2在铁皮石斛原球茎形成早期表达量较高，表明该基因对原球茎形成有促进作用;而在种子和花中表达量高，表明该基因对植物组织的生殖发育具有调控作用。
张岗等[14]从铁皮石斛中克隆得到转录因子基因DoWRKY3，该基因具有组织表达特异性，在铁皮石斛根和叶中相对表达量较高。
李依民等[15]从铁皮石斛中克隆到4个CIPK基因cDNA全长，研究表明4个CIPKs基因是铁皮石斛中新鉴定的类钙调磷酸酶B蛋白互作蛋白激酶编码基因，推测这4个基因通过不同的表达和作用方式参与石斛营养器官的生长发育过程。
刘思思等[16]首次克隆得到1个赤霉素3-氧化酶基因（DoGA3ox）的全长cDNA，通过研究发现该基因在铁皮石斛种子萌发中起着重要调控作用。
2 铁皮石斛次生代谢产物合成功能基因研究
多糖是铁皮石斛的主要次生代谢产物，也是铁皮石斛的主要有效成分。宋爽[17]通过进行铁皮石斛全基因组糖基转移酶分析，克隆得到铁皮石斛β-1，3葡聚糖合成酶基因部分序列，为研究多糖代谢途径提供参考。吕楠等[18]克隆尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）基因，推测该基因与多糖累积的活跃程度成正比例。
李依民等[19]利用RACE技术首次从铁皮石斛中分离到一个己糖转运蛋白基因cDNA全长DoHT1，并发现DoHT1是编码铁皮石斛己糖转运蛋白的新基因。
苗小荣等[20]克隆铁皮石斛中性/碱性转化酶（NI）家族基因DoNI2，该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中起重要作用。
沈王琴等[21]克隆铁皮石斛倍半萜合成酶基因（DoSES），并分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及在信号分子茉莉酸甲酯（MeJA）诱导下的表达模式，为进一步研究调控铁皮石斛萜类代谢奠定了基础。
3 铁皮石斛抗环境胁迫功能基因研究
钙依赖蛋白激酶（CDPK）是一类能响应低温等非生物胁迫的蛋白激酶。盛况等[22]研究发现铁皮石斛 DoCDPK6主要在叶片中表达，其次是茎和根;在4℃低温、脱落酸和NaCl胁迫处理后，DoCDPK6基因表达量均有不同程度的上调，推测DoCDPK6基因在低温等非生物胁迫中起到调控作用。汪园等[23]采用PCR技术克隆铁皮石斛DcCDPK8基因，通过研究明确了DcCDPK8对低温和激素的响应机制。 蒋园等[24]首次从铁皮石斛中克隆到一个WRKY基因，该基因在低温胁迫、ABA胁迫和蔗糖胁迫下均被诱导表达，推测DoWRKY5基因在铁皮石斛应答低温胁迫等多种非生物胁迫中可能起重要的调控作用。
裴薇等[25]通过对铁皮石斛多聚泛素基因DoUb1的克隆及表达分析，发现该基因对低温胁迫较敏感。
凌鸿等[26]首次获得了铁皮石斛晚期胚胎富集蛋白LEA2全长 cDNA序列，并验证了其耐盐胁迫功能。
4 小结
铁皮石斛功能基因的研究起步较晚，目前相关研究报道主要围绕克隆和表达模式分析，以及少数转基因功能验证方面的工作。铁皮石斛为我国珍稀名贵药材，目前具有良好的开发潜力和应用前景，应用现代基因工程技术，从基因层面阐释铁皮石斛生长发育、活性产物代谢调控、抗环境胁迫的分子基础及相关机制，对实现铁皮石斛人工种植、良种选育和产业化发展具有重要价值。
参考文献：
[1]丁鸽，张代臻，丁小余.石斛资源分子水平研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2018，24（4）：208-215.
[2]孙恒，胡强，金航，等.铁皮石斛化学成分及药理活性研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（11）：225-234.
[3]刘敬，邓仙梅，赵斌，等.铁皮石斛药理作用研究进展[J].亚太传统医药，2017，13（15）：27-30.
[4]张雪琴，赵庭梅，刘静，等.石斛化学成分及药理作用研究进展[J].中草药，2018，49（13）：3174-3182.
[5]陈勇，刘和平，唐海尧，等.铁皮石斛的组培快繁技术研究进展[J].现代园艺，2017，（18）：9-10.
[6]张治军.药用石斛质量控制新技术研究进展[J].海峡药学，2017，29（12）：46-49.
[7]刘亮亮，张娜，黑小斌，等.铁皮石斛蛋白磷酸酶2A基因的分子克隆研究[J].上海中医药杂志，2018，52（9）：61-64+68.
[8]张娜，刘亮亮，李欢，等.铁皮石斛蛋白磷酸酶DoPP2C1基因的克隆与表达分析[J].中草药，2018，49（7）：1661-1666.
[9]曹冠华，柏旭，陈迪，等.ABC转运蛋白结构特点及在植物和真菌重金属耐性中的作用与机制[J].农业生物技术学报，2016，24（10）：1617-1628.
[10]李依民，雷根平，顏永刚，等.铁皮石斛2个F家族ABC转运蛋白基因的克隆和表达研究[J].中草药，2017，48（15）：3153-3159.
[11]阎波，刘思思，陈娟，等.药用植物铁皮石斛ABC转运蛋白基因的鉴定及其差异表达分析[J].药学学报，2018，53（7）：1177-1189.
[12]李欢，陈莹，黑小斌，等.铁皮石斛过氧化氢酶基因DoCAT1的鉴定与表达分析[J].中国药学杂志，2018，53（17）：1447-1452.
[13]范静，毛欢，刘楚琪，等.铁皮石斛硫氧还蛋白基因（DoTrxL2）的克隆及表达分析[J].生物学杂志，2018，35（5）：18-22.
[14]张岗，刘思思，彭亮，等.铁皮石斛转录因子基因DoWRKY3的克隆与分子特性分析[J].中草药，2017，48（14）：2930-2936.
[15]李依民，张娜，沈霞，等.珍稀药用铁皮石斛4个CIPKs基因的鉴定与表达分析[J].药学学报，2018，53（2）：304-312.
[16]刘思思，张岗，陈晓梅，等.铁皮石斛赤霉素3-氧化酶基因的克隆及表达分析[J].中草药，2016，47（6）：990-996.
[17]宋爽.铁皮石斛糖基转移酶基因分析及β-1，3葡聚糖合成酶基因的克隆[D].云南农业大学，2016.
[18]吕楠，安红强，裴薇，等.铁皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆与分析[J].现代生物医学进展，2017，17（7）：1215-1219+1232.
[19]李依民，陈莹，刘阿萍，等.铁皮石斛己糖转运蛋白基因DoHT1的分离和表达分析[J].中国中药杂志，2018，43（6）：1124-1130.
[20]苗小荣，牛俊奇，莫昭展，等.铁皮石斛中性/碱性转化酶（DoNI2）基因的克隆和表达分析[J].中草药，2018，49（15）：3659-3666.
[21]沈王琴，陈龙龙，张传明，等.铁皮石斛倍半萜合成酶基因的克隆与表达分析[J].中草药，2017，48（23）：4963-4969.
[22]盛况，高燕会，斯金平，等.铁皮石斛DoCDPK6基因及启动子的克隆与表达分析[J].农业生物技术学报，2017，25（4）：588-598.
[23]汪园，高燕会，朱玉球，等.铁皮石斛DcCDPK8基因启动子克隆及功能分析[J].中国中药杂志：1-8.
[24]蒋园，朱玉球，高燕会，等.铁皮石斛WRKY5基因的克隆与表达分析[J].中草药，2016，47（2）：301-308.
[25]裴薇，梁易，范静，等.铁皮石斛多聚泛素基因Polyubiquitin1（DoUb1）的克隆及表达分析[J].生物学杂志，2017，34（3）：6-10.
[26]凌鸿，曾旭，郭顺星.铁皮石斛DoLEA2基因的克隆、表达及功能分析[J].药学学报，2017，52（8）：1337-1344.
（收稿日期：2020-12-02）