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目的:应用流式细胞仪对兔骨髓间充质干细胞的表面抗原进行检测,观察骨髓间充质干细胞传代次数、克隆纯化与骨髓间充质干细胞表面抗原表达之间的关系。方法:实验于2004-01/2006-08在浙江省医学科学院生物工程所完成。取3月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。兔骨髓间充质干细胞的克隆化:将铺满培养瓶底的原代骨髓间充质干细胞,用D-Hanks液小心的洗1次,加入0.25%胰蛋白酶消化约4min,弃消化液,加LG-DMEM培养液收集细胞,1000r/min,离心10min,然后用LG-DMEM培养液充分混匀沉淀细胞。细胞计数后以10倍递减稀释至细胞密度为103个/mL。取0.1mL稀释后的细胞悬液加入10mL培养液,使最终细胞密度为10个/mL。将细胞悬液加入96孔培养板,每孔100μL。置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养,每天观察克隆细胞的增殖生长状况。待克隆细胞生长至60%～80%融合时,逐步扩大培养,在液氮冻存保种的同时进行细胞连续传代。将体外普通法分离的骨髓间充质干细胞第5代、第7代、第13代、第16代、第21代、第22代及克隆纯化的骨髓间充质干细胞第3代、第5代、第15代、第26代均标记上CD14-FITC及CD44-PE,通过流式细胞仪检测其阴性率及阳性率。结果:①普通法分离的骨髓间充质干细胞各代的CD44表达呈阳性,且随着培养代次的增加,其表达的阳性率逐渐增强,到P16代以后又呈下降趋势;各代骨髓间充质干细胞表面抗原CD14出现了微弱阳性,但随着培养代次增加,其阳性率呈下降趋势。②克隆纯化的骨髓间充质干细胞其CD44呈现阳性,表达在80%以上,至P26代时CD44表达下降到70.49%;其CD14基本呈阴性。结论:兔骨髓间充质干细胞其CD44呈阳性表达,CD14呈阴性表达。随着传代代数增加CD14阴性符合率逐渐提高,CD44阳性表达率也提高。普通法分离的骨髓间充质干细胞较克隆纯化的骨髓间充质干细胞CD14阴性符合率差,前者的CD44阳性表达率也较后者低。