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基金项目 2006年度宁夏自治区教育厅资助项目（W200634）
摘 要 目的：探讨培养兔角膜缘干细胞，自体移值治疗眼表碱烧伤的可行性。方法：体外培养兔角膜缘干细胞，传代于去上皮羊膜，自体移植治疗眼表碱烧伤；术后应用裂隙灯观察、免疫组化、透视电镜等方法，与单纯羊膜移植组疗效进行对比。结果：体外培养细胞既有角膜上皮特性，又具有强的增殖潜力。培养细胞移植组术后角膜上皮完整，炎症化、血管化减轻，与单纯羊膜移植组各项指标差异有显著性意义。结论：培养角膜缘干细胞移植术可有效重建眼表。
关键词 细胞培养 羊膜 碱烧伤
资料与方法
实验动物：健康新西兰大白兔24只，体重2.0~2.5kg，雌雄兼有，完全随机分为两组，培养角膜缘干细胞移植组12只，单纯羊膜移植组12只。
羊膜准备：健康剖宫产孕妇取羊膜，用含青链、庆大、两性霉素的平衡盐溶液反复冲洗，剪成10cm×10cm大小，平铺于纤维膜上，培养液和甘油混合液-20℃保存1个月。取1块羊膜培养，检测无菌后使用。复水30分钟，单纯羊膜移植组直接应用，去上皮羊膜培养组加入胰蛋白酶EDTA液37℃消化20分钟，刮除全部羊膜上皮细胞，修剪成4cm×4cm大小，钻掉35mm培养皿的底，将剪好的羊膜包于其上，缝线固定。
细胞培养：DMEM和Ham’sF12混合增养基（1∶1），胎牛血清20%，加入表皮生长因子、谷氨酰胺、胰岛素、青链霉素等，pH7.2~7.4。取1cm角膜缘组织，0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液（1∶1）37℃消化10分钟，重悬细胞及组织块共同移入培养基，37℃，0.05CO2培养， 隔日换液，接种后4天祛除组织块，至对数生长期传代，按5×104个/ml接种于33mm培养皿培养中，羊膜上皮面对应传代细胞层，基底面对应含3T3成纤维细胞的66mm培养皿，加入培养液使羊膜片处于气-液界面水平，37℃，0.05CO2培养，隔日换液，细胞至对数生长期，AE5细胞免疫鉴定后移植。
动物模型制作、鉴定及手术治疗：完全随机选取1眼，环形剪开结膜，将浸透1mol/L氢氧化钠溶液的滤纸环片（内径8mm,外径14mm）置于兔角膜缘，玻璃棒轻压30秒，生理盐水彻底冲洗。烧伤后10天行印迹细胞学检查，模型建立成功者行移植手术。彻底清除坏死组织，羊膜上皮面向下10.0尼龙线间断缝合固定于浅层巩膜，结膜下注射抗生素。每日妥布霉素眼液5次，眼膏1次。
术后检查：10、20天行裂隙灯检查，21天空气栓塞处死动物，1/2角膜AE5单克隆抗体免疫组化检查，1/2透视电镜检查。
统计学处理：采用列联表资料卡方检验，以P<0.05为差异有显著性。
结果
细胞增养：接种24小时见细胞贴壁，组织块边缘出现典型的“沙滩状”移行带，培养7天细胞达80%汇合状态；去上皮羊膜上传代细胞3天开始成片生长，7天基本汇合成单层，15天整个羊膜覆盖排列致密的复层细胞；复层细胞AE5免疫鉴定呈强阳性，表层细胞扁平，基底细胞呈柱状，与正常角膜上皮结构相似。
动物模型：烧伤眼上下角膜缘区均可见大量PAS染色阳性的杯状结膜上皮细胞，原来存在的多角形或圆形PAS染色阴性的角膜上皮细胞已很少见，提示该处角膜上皮已结膜化，说明已制成角膜缘干细胞严重缺乏兔模型。
大体检查：①培养移植组：角膜透明度增加，新生血管较少，角膜上皮荧光染色阴性。②羊膜移植组：角膜混浊水肿略好转，四周均见新生血管，结膜上皮覆盖角膜缘及部分角膜，荧光染色大部分呈阳性。③列联表资料卡方检验：角膜混浊，X2=19．200；角膜新生血管，X2=12．571；荧光素角膜染色，X2=24．000；角膜结膜化，X2=24．000；各组P<0．05，两组间差异均有显著性。
AE5免疫学检查：①培养移植组：羊膜大部分溶解，其下见排列整齐的复层柱状或扁平状角膜上皮细胞，AE5染色阳性，偶见炎性细胞，未见杯状细胞和新生血管。②羊膜移植组：羊膜变薄、脱落，角膜上皮仅见1~2层细胞，排列不整，周边部见杯状结膜细胞，AE5染色阴性，基质屋胶原纤维排列紊乱，炎性细胞浸润，新生血管较多。
透视电镜检查：①培养移植组：角膜全层轻度增厚，未溶解羊膜与角膜连接紧密，角膜上皮细胞呈复层，立体感强，细胞器丰富，细胞之间可见桥粒连接和镶嵌连接，基底膜完整，角膜基质层胶原纤维排列整齐。②羊膜移植组：角膜厚薄不均，上皮层缺如，仅见1~2层细胞，胞质空泡样改变，细胞溶解，基底膜欠完整，基质层变薄，成纤维细胞坏死、少量新生血管，炎性细胞侵入。
讨论
动物模型：印迹细胞学检查具有创伤小，快速、简便、易行，检验部位自由、全面等优点。严重眼表碱烧伤，角膜缘干细胞严重受损缺失，早期表现为角膜上皮广泛结膜化。本实验通过印迹细胞学观察眼球表面病理变化，判断全角膜缘干细胞缺乏的程度和部位［1］，调整碱烧伤作用浓度和时间，制作出合格动物模型。
细胞培养：为获得更多细胞［2］，本实验在严格控制胰蛋白酶作用时间和浓度的同时，采取了组织块培养与分散细胞培养相结合的方法，分散细胞易于从培养液摄取营养、排出废物，组织块易贴壁、促进细胞生长成膜。近期研究发现去上皮羊膜能提供更理想的细胞基质，促进细胞生长动力学，有利于细胞和基底层之间的黏附、增殖和分化；气-液界面、3T3成纤维细胞使培养环境接近正常角膜上皮生存状态，有利于细胞自然分化，又具有强的增殖潜力，可用于移植治疗。
移植效果：本实验结果显示自体角膜缘干细胞移植术有良好的修复效果，干细胞羊膜片移植后，植片在受体植床与巩膜和结膜融合为一体，未发生排斥反应，兔角膜上皮恢复复层结构，细胞AE5染色强阳性，细胞器丰富，说明移植的细胞在受体角膜表面存活并进行分化增殖形成角膜上皮细胞。而单纯羊膜移植组，角膜混浊水肿虽明显好转，但AE5免疫组化呈阴性，角膜结膜化、血管化严重，表明单纯羊膜移植只能起到减轻炎症反应、降低胶原蛋白溶角等暂时作用，为角膜缘干细胞移植等后续治疗提供一定的条件。
参考文献
1 Mckelvie P,et al.Ocular surface impression cytology.Anat Pathol,2003,10:328-337.
2 易敬林，钟文贤.胎儿角膜缘干细胞的体外培养和生物学特性观察.眼科研究，2005，23（5）：465.
摘 要 目的：探讨培养兔角膜缘干细胞，自体移值治疗眼表碱烧伤的可行性。方法：体外培养兔角膜缘干细胞，传代于去上皮羊膜，自体移植治疗眼表碱烧伤；术后应用裂隙灯观察、免疫组化、透视电镜等方法，与单纯羊膜移植组疗效进行对比。结果：体外培养细胞既有角膜上皮特性，又具有强的增殖潜力。培养细胞移植组术后角膜上皮完整，炎症化、血管化减轻，与单纯羊膜移植组各项指标差异有显著性意义。结论：培养角膜缘干细胞移植术可有效重建眼表。
关键词 细胞培养 羊膜 碱烧伤
资料与方法
实验动物：健康新西兰大白兔24只，体重2.0~2.5kg，雌雄兼有，完全随机分为两组，培养角膜缘干细胞移植组12只，单纯羊膜移植组12只。
羊膜准备：健康剖宫产孕妇取羊膜，用含青链、庆大、两性霉素的平衡盐溶液反复冲洗，剪成10cm×10cm大小，平铺于纤维膜上，培养液和甘油混合液-20℃保存1个月。取1块羊膜培养，检测无菌后使用。复水30分钟，单纯羊膜移植组直接应用，去上皮羊膜培养组加入胰蛋白酶EDTA液37℃消化20分钟，刮除全部羊膜上皮细胞，修剪成4cm×4cm大小，钻掉35mm培养皿的底，将剪好的羊膜包于其上，缝线固定。
细胞培养：DMEM和Ham’sF12混合增养基（1∶1），胎牛血清20%，加入表皮生长因子、谷氨酰胺、胰岛素、青链霉素等，pH7.2~7.4。取1cm角膜缘组织，0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液（1∶1）37℃消化10分钟，重悬细胞及组织块共同移入培养基，37℃，0.05CO2培养， 隔日换液，接种后4天祛除组织块，至对数生长期传代，按5×104个/ml接种于33mm培养皿培养中，羊膜上皮面对应传代细胞层，基底面对应含3T3成纤维细胞的66mm培养皿，加入培养液使羊膜片处于气-液界面水平，37℃，0.05CO2培养，隔日换液，细胞至对数生长期，AE5细胞免疫鉴定后移植。
动物模型制作、鉴定及手术治疗：完全随机选取1眼，环形剪开结膜，将浸透1mol/L氢氧化钠溶液的滤纸环片（内径8mm,外径14mm）置于兔角膜缘，玻璃棒轻压30秒，生理盐水彻底冲洗。烧伤后10天行印迹细胞学检查，模型建立成功者行移植手术。彻底清除坏死组织，羊膜上皮面向下10.0尼龙线间断缝合固定于浅层巩膜，结膜下注射抗生素。每日妥布霉素眼液5次，眼膏1次。
术后检查：10、20天行裂隙灯检查，21天空气栓塞处死动物，1/2角膜AE5单克隆抗体免疫组化检查，1/2透视电镜检查。
统计学处理：采用列联表资料卡方检验，以P<0.05为差异有显著性。
结果
细胞增养：接种24小时见细胞贴壁，组织块边缘出现典型的“沙滩状”移行带，培养7天细胞达80%汇合状态；去上皮羊膜上传代细胞3天开始成片生长，7天基本汇合成单层，15天整个羊膜覆盖排列致密的复层细胞；复层细胞AE5免疫鉴定呈强阳性，表层细胞扁平，基底细胞呈柱状，与正常角膜上皮结构相似。
动物模型：烧伤眼上下角膜缘区均可见大量PAS染色阳性的杯状结膜上皮细胞，原来存在的多角形或圆形PAS染色阴性的角膜上皮细胞已很少见，提示该处角膜上皮已结膜化，说明已制成角膜缘干细胞严重缺乏兔模型。
大体检查：①培养移植组：角膜透明度增加，新生血管较少，角膜上皮荧光染色阴性。②羊膜移植组：角膜混浊水肿略好转，四周均见新生血管，结膜上皮覆盖角膜缘及部分角膜，荧光染色大部分呈阳性。③列联表资料卡方检验：角膜混浊，X2=19．200；角膜新生血管，X2=12．571；荧光素角膜染色，X2=24．000；角膜结膜化，X2=24．000；各组P<0．05，两组间差异均有显著性。
AE5免疫学检查：①培养移植组：羊膜大部分溶解，其下见排列整齐的复层柱状或扁平状角膜上皮细胞，AE5染色阳性，偶见炎性细胞，未见杯状细胞和新生血管。②羊膜移植组：羊膜变薄、脱落，角膜上皮仅见1~2层细胞，排列不整，周边部见杯状结膜细胞，AE5染色阴性，基质屋胶原纤维排列紊乱，炎性细胞浸润，新生血管较多。
透视电镜检查：①培养移植组：角膜全层轻度增厚，未溶解羊膜与角膜连接紧密，角膜上皮细胞呈复层，立体感强，细胞器丰富，细胞之间可见桥粒连接和镶嵌连接，基底膜完整，角膜基质层胶原纤维排列整齐。②羊膜移植组：角膜厚薄不均，上皮层缺如，仅见1~2层细胞，胞质空泡样改变，细胞溶解，基底膜欠完整，基质层变薄，成纤维细胞坏死、少量新生血管，炎性细胞侵入。
讨论
动物模型：印迹细胞学检查具有创伤小，快速、简便、易行，检验部位自由、全面等优点。严重眼表碱烧伤，角膜缘干细胞严重受损缺失，早期表现为角膜上皮广泛结膜化。本实验通过印迹细胞学观察眼球表面病理变化，判断全角膜缘干细胞缺乏的程度和部位［1］，调整碱烧伤作用浓度和时间，制作出合格动物模型。
细胞培养：为获得更多细胞［2］，本实验在严格控制胰蛋白酶作用时间和浓度的同时，采取了组织块培养与分散细胞培养相结合的方法，分散细胞易于从培养液摄取营养、排出废物，组织块易贴壁、促进细胞生长成膜。近期研究发现去上皮羊膜能提供更理想的细胞基质，促进细胞生长动力学，有利于细胞和基底层之间的黏附、增殖和分化；气-液界面、3T3成纤维细胞使培养环境接近正常角膜上皮生存状态，有利于细胞自然分化，又具有强的增殖潜力，可用于移植治疗。
移植效果：本实验结果显示自体角膜缘干细胞移植术有良好的修复效果，干细胞羊膜片移植后，植片在受体植床与巩膜和结膜融合为一体，未发生排斥反应，兔角膜上皮恢复复层结构，细胞AE5染色强阳性，细胞器丰富，说明移植的细胞在受体角膜表面存活并进行分化增殖形成角膜上皮细胞。而单纯羊膜移植组，角膜混浊水肿虽明显好转，但AE5免疫组化呈阴性，角膜结膜化、血管化严重，表明单纯羊膜移植只能起到减轻炎症反应、降低胶原蛋白溶角等暂时作用，为角膜缘干细胞移植等后续治疗提供一定的条件。
参考文献
1 Mckelvie P,et al.Ocular surface impression cytology.Anat Pathol,2003,10:328-337.
2 易敬林，钟文贤.胎儿角膜缘干细胞的体外培养和生物学特性观察.眼科研究，2005，23（5）：465.