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摘 要：用高浓度CO2气体胁迫处理药材甲老熟幼虫及体外磷酸酯酶，通过终点法测定酶活性变化，分析气调胁迫与磷酸酯酶活性变化之间的关系。结果显示，高浓度CO2密闭处理药材甲老熟幼虫6 h和12 h，ACP比活力分别升高6.41％和18.96％，ALP活力分别降低了7.69％和7.91％。ACP经CO2体外处理30、60、120 min，比活力分别增强92.77％、127.43％和67.91％。可见，高浓度CO2气调胁迫处理对药材甲老熟幼虫ACP和ALP活力均有一定影响。
关键词：药材甲；高浓度CO2气调；磷酸酯酶；比活力
中图分类号：Q 965．9
储藏产品，尤其是直接供人畜食用或药用的产品害虫防治策略与大田农业害虫防治策略有根本的区别，前者对农药残留问题更为重视。药材甲[Stegobium paniceum(L.)]隶属于鞘翅目(Coleop-tera)窃蠹科(Anobiidae)，是一种典型的世界性分布储藏物甲虫，近年在贵阳地区发生和为害猖獗，药业损失严重。该虫是最常见的中药材储藏期害虫之一，已有研究证明利用高浓度CO2和低浓度O2协同作用来控制储藏物害虫安全可行、健康环保，作者尝试了高浓度CO2气调在中药材害虫防治中的应用，开展了药材甲气调毒理学的基础研究。
对硝基苯基磷酸二钠(Merck)和对硝基苯酚为天津光复精细化工研究所产品，巴比妥钠为国药集团化学试剂有限公司产品，考马斯亮蓝G-250为sigma产品，牛血清白蛋白为Roche产品；酶标仪(Tecan产)；高速冰冻离心机(sigma产)。
1．3 生物测定与昆虫气调处理
同龄老熟幼虫60头置于20 cm×30 cm×20 cm可充气密闭塑料培养盒中，用气体混配仪(长沙长锦科技有限公司产)通人CO2和空气的混合气体，CO2占75％，空气占25％(体积比)，分别处理6～54 h，相同环境条件下空气处理作为对照。死亡标准确定：处理昆虫移出气调环境，室温条件恢复6 h后，以毛刷子刺激不动视为死亡。试验重复3次。
1．4 酶液提取与制备
本研究分别进行了高浓度CO2处理幼虫后提取酶液和对未处理过的昆虫提取酶液进行体外处理两类试验。前者酶液提取方法为：取老熟幼虫30头，置于20 cm×30 cm×20 cm密闭培养盒中，通入高浓度CO2气体分别处理o h(置于空气环境中，作为对照处理)、6 h和12 h(根据生物测定结果，处理时间内死亡率在10％以下)，转入玻璃匀浆器，加入预冷处理的pH 4.6，0.2 mol／L醋酸缓冲液0.4 mL，冰液充分匀浆，后加入7.6 mL相同缓冲液混匀，分装于8支1.5 mL离心管，于10 000 r／min，4℃离心15 min，取上清液于4℃冰箱中保存，24 h内使用。体外处理试验则将未经CO2处理的昆虫，直接如上述方法提取酶液，活性测定试验前，酶液用高浓度CO2进行体外处理。
碱性磷酸酯酶ALP的提取方法同ACP提取，将缓冲液改为pH 9.6，0.04 mol／L巴比妥钠一盐酸缓冲液即可。
1．5 酶液体外处理
将未处理幼虫直接提取的酶液混匀分装于4支相同的试管中，置于37℃恒温水浴，持续通入高浓度CO2气体，流速100mL／min，分别处理30、60、120 min时测定酶活性，取等量酶液不通气置于相同水浴温度条件下，静置对应时间作对照处理。
1．6 制作标准曲线
用去离子水配制7.5 mmol／L对硝基苯酚标准溶液，于8支5 mL试管中分别加入标准溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，用0.2 m01／L醋酸缓冲液配平至3.0 mL，于37℃水浴静置30 min后取出，加入0.2 mol／L氢氧化钠溶液2.0 mL，室温静置10 min后于400 nm处测OD值。以对硝基苯酚浓度为自变量(x)，其在400 nm处的OD值为因变量(y)，回归制作标准曲线，得标准物质对硝基苯酚在酸性条件下的标准曲线。
如上方法，将缓冲液换为0.04 mol／L巴比妥钠一盐酸缓冲液，氢氧化钠浓度调整为0.1 mol／L，制作对硝基苯酚在碱性条件下的标准曲线。同样，配制牛血清白蛋白标准溶液，设定不同浓度于595 nm处测定OD值，以牛血清白蛋白浓度作自变量(x)，其在595 nm处的吸光度值为因变量(y)，得到标准 曲线。
1．7 酶活性测定和数据处理
参照Bradford等的方法，用考马斯亮蓝G-250法测定酶源蛋白含量，以牛血清白蛋白制作标准曲线。参照Bessey的方法，用对硝基苯酚制作标准曲线。底物对硝基苯基磷酸二钠在磷酸酯酶的作用下，水解生成对硝基苯酚，在碱性条件下呈黄色，于400 nm波长处比色测定OD值。酶活性测定反应体系中含5×10-4mol／L对硝基苯基磷酸二钠0.5 mL，酶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，反应总体积用0.2 mol／L醋酸缓冲液配平至3.0 mL，混合液于37℃恒温水浴反应30 min后，立即加入0.2 mol／L氢氧化钠2.0 mL终止反应(测定ALP活性时将氢氧化钠浓度换为0.1 mol／L，缓冲液换为0.04 mol／L巴比妥钠－盐酸缓冲液)，室温静置10 min，于400nm处测定OD值。
根据标准曲线和酶源蛋白含量的测定结果，将酶液用量(mL)转换成酶液蛋白含量(mg)，将酶活性测定结果的OD值换算为相当于标准物质对硝基苯酚的量(μmol)，然后以蛋白质含量(mg)为横坐标，对硝基苯酚的量(μmol)为纵坐标，进行回归制作活力曲线，该曲线的斜率即为相应ACP或ALP的比活力μmol／mg·(30 min)-1。
2 结果与分析
2．1 生物测定
药材甲老熟幼虫经高浓度CO2处理后，死亡率曲线如图1所示。处理18 h内，药材甲幼虫死亡率均很低，多数处于昏迷状态，移出处理环境6 h可复活，属于“击倒”不记人死亡。处理30 h时，平均死亡率升高至50％。经回归分析(SPSS 11.5，Probit Analysis)，半数死亡时间LT50为30.022 h，95％置信限为28.588～31.426 h。可见，如果需要通过高浓度CO2气调处理来杀灭药材甲幼虫，全面密闭处理48 h是必要的。实践中还应考虑药材甲幼虫蛀食于药材内部为害的特点，因此，处理时间应超过48 h。
2．2 标准曲线应用
对硝基苯酚在酸／碱性条件下的标准曲线分别为：ya=11.624 x 0.004，R2=0.999 3**；yb=11.377 x 0.002，R2=0.998**。牛血清蛋白标准曲线为：y=0.018 6 x 0.026，R2=0.998**，用作酶源蛋白含量定量测定标准。以上3个标准曲线线性关系均极显著。
2．3 药材甲老熟幼虫高浓度CO2胁迫下磷酸酯酶比活力
药材甲老熟幼虫经高浓度CO2密闭处理6 h和12 h，其磷酸酯酶活力曲线如表1所示。曲线斜率即为相应处理下的磷酸酯酶比活力。老熟幼虫在高浓度CO2环境中密闭处理6 h和12 h，其ACP比活力分别升高6.41％和18.96％，而ALP活力则分别降低了7.69％和7.91％。
2．4 药材甲老熟幼虫ACP酶液体外处理后酶活力
未经高浓度CO2处理之药材甲老熟幼虫提取ACP，酶液经体外持续通入高浓度CO2气体处理30、60、120 min，其活力曲线如表2所示。曲线的回归方程斜率即为相应处理下的ACP比活力。高浓度CO2体外处理30、60、120 min，比活力分别增强92.77％、127.43％和67.91％。可见，药材甲老熟幼虫ACP在高浓度CO2体外处理下，其比活力有不同程度的升高。
3 结论与讨论
磷酸酯酶性质的改变是导致昆虫对有机磷类等农药产生抗性的原因之一，昆虫可以通过磷酸酯酶活性的增强来提高对外源性毒物的解毒能力，这种能力最终发展为抗性，昆虫对气调处理产生抗性与若干酶的活性变化有关。过去人们对CO2气调处理对昆虫作用的研究，主要集中于通过CO2与其他气体的配比设计来提高对昆虫的杀伤效果，很少有研究关注CO2气调处理对昆虫生理生化活动的影响，目前还没有发现有关CO2气调处理对药材甲磷酸酯酶活力影响的正式报道。本研究中高浓度CO2气调处理药材甲老熟幼虫可导致其磷酸酯酶活力的变化，高浓度CO2气体作用于药材甲老熟幼虫机体，其体内的ACP活性增强，ALP活性稍微受到抑制，高浓度CO2对ALP和ACP活性作用不一致，可能与CO2进入虫体内富集后，改变了体液的酸碱性平衡有关，因pH降低，致使碱性磷酸酯酶活力受到抑制。
药材甲老熟幼虫未经CO2处理提取ACP，酶液经高浓度CO2体外处理30～120 min，其比活力均显著升高，这个结果与高浓度CO2直接处理药材甲幼虫相似，其差异在于体外处理的作用更明显，说明CO2对药材甲幼虫ACP确有激活作用。这一结果与其他已知的外源性毒物如a-T等对昆虫作用的方式不一致，a-T的作用抑制了ACP和ALP的活性，而高浓度CO2作用虽然对ALP有轻微的抑制作用，但却激活了ACP的解毒能力，可见，高浓度CO2气调的杀虫与a-T的作用机理可能是不同的。这一结果的发现，对于认识气调作用对储藏物害虫控制的作用机理有积极意义。
关键词：药材甲；高浓度CO2气调；磷酸酯酶；比活力
中图分类号：Q 965．9
储藏产品，尤其是直接供人畜食用或药用的产品害虫防治策略与大田农业害虫防治策略有根本的区别，前者对农药残留问题更为重视。药材甲[Stegobium paniceum(L.)]隶属于鞘翅目(Coleop-tera)窃蠹科(Anobiidae)，是一种典型的世界性分布储藏物甲虫，近年在贵阳地区发生和为害猖獗，药业损失严重。该虫是最常见的中药材储藏期害虫之一，已有研究证明利用高浓度CO2和低浓度O2协同作用来控制储藏物害虫安全可行、健康环保，作者尝试了高浓度CO2气调在中药材害虫防治中的应用，开展了药材甲气调毒理学的基础研究。
对硝基苯基磷酸二钠(Merck)和对硝基苯酚为天津光复精细化工研究所产品，巴比妥钠为国药集团化学试剂有限公司产品，考马斯亮蓝G-250为sigma产品，牛血清白蛋白为Roche产品；酶标仪(Tecan产)；高速冰冻离心机(sigma产)。
1．3 生物测定与昆虫气调处理
同龄老熟幼虫60头置于20 cm×30 cm×20 cm可充气密闭塑料培养盒中，用气体混配仪(长沙长锦科技有限公司产)通人CO2和空气的混合气体，CO2占75％，空气占25％(体积比)，分别处理6～54 h，相同环境条件下空气处理作为对照。死亡标准确定：处理昆虫移出气调环境，室温条件恢复6 h后，以毛刷子刺激不动视为死亡。试验重复3次。
1．4 酶液提取与制备
本研究分别进行了高浓度CO2处理幼虫后提取酶液和对未处理过的昆虫提取酶液进行体外处理两类试验。前者酶液提取方法为：取老熟幼虫30头，置于20 cm×30 cm×20 cm密闭培养盒中，通入高浓度CO2气体分别处理o h(置于空气环境中，作为对照处理)、6 h和12 h(根据生物测定结果，处理时间内死亡率在10％以下)，转入玻璃匀浆器，加入预冷处理的pH 4.6，0.2 mol／L醋酸缓冲液0.4 mL，冰液充分匀浆，后加入7.6 mL相同缓冲液混匀，分装于8支1.5 mL离心管，于10 000 r／min，4℃离心15 min，取上清液于4℃冰箱中保存，24 h内使用。体外处理试验则将未经CO2处理的昆虫，直接如上述方法提取酶液，活性测定试验前，酶液用高浓度CO2进行体外处理。
碱性磷酸酯酶ALP的提取方法同ACP提取，将缓冲液改为pH 9.6，0.04 mol／L巴比妥钠一盐酸缓冲液即可。
1．5 酶液体外处理
将未处理幼虫直接提取的酶液混匀分装于4支相同的试管中，置于37℃恒温水浴，持续通入高浓度CO2气体，流速100mL／min，分别处理30、60、120 min时测定酶活性，取等量酶液不通气置于相同水浴温度条件下，静置对应时间作对照处理。
1．6 制作标准曲线
用去离子水配制7.5 mmol／L对硝基苯酚标准溶液，于8支5 mL试管中分别加入标准溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，用0.2 m01／L醋酸缓冲液配平至3.0 mL，于37℃水浴静置30 min后取出，加入0.2 mol／L氢氧化钠溶液2.0 mL，室温静置10 min后于400 nm处测OD值。以对硝基苯酚浓度为自变量(x)，其在400 nm处的OD值为因变量(y)，回归制作标准曲线，得标准物质对硝基苯酚在酸性条件下的标准曲线。
如上方法，将缓冲液换为0.04 mol／L巴比妥钠一盐酸缓冲液，氢氧化钠浓度调整为0.1 mol／L，制作对硝基苯酚在碱性条件下的标准曲线。同样，配制牛血清白蛋白标准溶液，设定不同浓度于595 nm处测定OD值，以牛血清白蛋白浓度作自变量(x)，其在595 nm处的吸光度值为因变量(y)，得到标准 曲线。
1．7 酶活性测定和数据处理
参照Bradford等的方法，用考马斯亮蓝G-250法测定酶源蛋白含量，以牛血清白蛋白制作标准曲线。参照Bessey的方法，用对硝基苯酚制作标准曲线。底物对硝基苯基磷酸二钠在磷酸酯酶的作用下，水解生成对硝基苯酚，在碱性条件下呈黄色，于400 nm波长处比色测定OD值。酶活性测定反应体系中含5×10-4mol／L对硝基苯基磷酸二钠0.5 mL，酶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，反应总体积用0.2 mol／L醋酸缓冲液配平至3.0 mL，混合液于37℃恒温水浴反应30 min后，立即加入0.2 mol／L氢氧化钠2.0 mL终止反应(测定ALP活性时将氢氧化钠浓度换为0.1 mol／L，缓冲液换为0.04 mol／L巴比妥钠－盐酸缓冲液)，室温静置10 min，于400nm处测定OD值。
根据标准曲线和酶源蛋白含量的测定结果，将酶液用量(mL)转换成酶液蛋白含量(mg)，将酶活性测定结果的OD值换算为相当于标准物质对硝基苯酚的量(μmol)，然后以蛋白质含量(mg)为横坐标，对硝基苯酚的量(μmol)为纵坐标，进行回归制作活力曲线，该曲线的斜率即为相应ACP或ALP的比活力μmol／mg·(30 min)-1。
2 结果与分析
2．1 生物测定
药材甲老熟幼虫经高浓度CO2处理后，死亡率曲线如图1所示。处理18 h内，药材甲幼虫死亡率均很低，多数处于昏迷状态，移出处理环境6 h可复活，属于“击倒”不记人死亡。处理30 h时，平均死亡率升高至50％。经回归分析(SPSS 11.5，Probit Analysis)，半数死亡时间LT50为30.022 h，95％置信限为28.588～31.426 h。可见，如果需要通过高浓度CO2气调处理来杀灭药材甲幼虫，全面密闭处理48 h是必要的。实践中还应考虑药材甲幼虫蛀食于药材内部为害的特点，因此，处理时间应超过48 h。
2．2 标准曲线应用
对硝基苯酚在酸／碱性条件下的标准曲线分别为：ya=11.624 x 0.004，R2=0.999 3**；yb=11.377 x 0.002，R2=0.998**。牛血清蛋白标准曲线为：y=0.018 6 x 0.026，R2=0.998**，用作酶源蛋白含量定量测定标准。以上3个标准曲线线性关系均极显著。
2．3 药材甲老熟幼虫高浓度CO2胁迫下磷酸酯酶比活力
药材甲老熟幼虫经高浓度CO2密闭处理6 h和12 h，其磷酸酯酶活力曲线如表1所示。曲线斜率即为相应处理下的磷酸酯酶比活力。老熟幼虫在高浓度CO2环境中密闭处理6 h和12 h，其ACP比活力分别升高6.41％和18.96％，而ALP活力则分别降低了7.69％和7.91％。
2．4 药材甲老熟幼虫ACP酶液体外处理后酶活力
未经高浓度CO2处理之药材甲老熟幼虫提取ACP，酶液经体外持续通入高浓度CO2气体处理30、60、120 min，其活力曲线如表2所示。曲线的回归方程斜率即为相应处理下的ACP比活力。高浓度CO2体外处理30、60、120 min，比活力分别增强92.77％、127.43％和67.91％。可见，药材甲老熟幼虫ACP在高浓度CO2体外处理下，其比活力有不同程度的升高。
3 结论与讨论
磷酸酯酶性质的改变是导致昆虫对有机磷类等农药产生抗性的原因之一，昆虫可以通过磷酸酯酶活性的增强来提高对外源性毒物的解毒能力，这种能力最终发展为抗性，昆虫对气调处理产生抗性与若干酶的活性变化有关。过去人们对CO2气调处理对昆虫作用的研究，主要集中于通过CO2与其他气体的配比设计来提高对昆虫的杀伤效果，很少有研究关注CO2气调处理对昆虫生理生化活动的影响，目前还没有发现有关CO2气调处理对药材甲磷酸酯酶活力影响的正式报道。本研究中高浓度CO2气调处理药材甲老熟幼虫可导致其磷酸酯酶活力的变化，高浓度CO2气体作用于药材甲老熟幼虫机体，其体内的ACP活性增强，ALP活性稍微受到抑制，高浓度CO2对ALP和ACP活性作用不一致，可能与CO2进入虫体内富集后，改变了体液的酸碱性平衡有关，因pH降低，致使碱性磷酸酯酶活力受到抑制。
药材甲老熟幼虫未经CO2处理提取ACP，酶液经高浓度CO2体外处理30～120 min，其比活力均显著升高，这个结果与高浓度CO2直接处理药材甲幼虫相似，其差异在于体外处理的作用更明显，说明CO2对药材甲幼虫ACP确有激活作用。这一结果与其他已知的外源性毒物如a-T等对昆虫作用的方式不一致，a-T的作用抑制了ACP和ALP的活性，而高浓度CO2作用虽然对ALP有轻微的抑制作用，但却激活了ACP的解毒能力，可见，高浓度CO2气调的杀虫与a-T的作用机理可能是不同的。这一结果的发现，对于认识气调作用对储藏物害虫控制的作用机理有积极意义。