【摘 要】
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目的 探讨ABx亚型相关的B型糖基转移酶(GTB)突变p.R180C的酶动力学特征.方法 以本课题组已构建的野生型GTB-pcDNA3.1真核表达载体为基础,采用定点突变试剂盒构建携带GTB突变p
【机 构】
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上海交通大学医学院附属瑞金医院临床输血科,上海200025
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目的 探讨ABx亚型相关的B型糖基转移酶(GTB)突变p.R180C的酶动力学特征.方法 以本课题组已构建的野生型GTB-pcDNA3.1真核表达载体为基础,采用定点突变试剂盒构建携带GTB突变p.R180C的表达载体突变体,并以DNA直接测序法验证突变质粒的序列;以野生型和突变型表达载体转化人胚肾上皮细胞(293F)做蛋白表达;再将经亲和柱Ni-IDA纯化后的表达蛋白以SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法鉴定;最后采用酶动力学活性检测试剂盒检测酶动力学参数米氏常数(Km)和催化常数(Kcat).结果 DNA直接测序:成功构建野生型和突变型GTB-pcDNA3.1真核表达载体;SDS-聚丙酰胺凝胶电泳:野生型和突变型GTB蛋白在293F内成功表达并获得纯化;酶动力学检测:p.R180C突变型GTB的Kcat及Km值分别为野生型GTB的1.7％、3.4倍[岩藻糖(H)受体]与25％、5.2倍[二磷酸尿苷半乳糖(UDP-Gal)供体].结论 GTB突变p.R180C降低了该酶对H受体和UDP-Gal供体的亲和力和其催化速率,尤其是对H受体的催化速率,进而导致了红细胞表面H抗原生成B抗原的含量减少.
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