【摘 要】
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[目的]构建牛肠激酶轻链(EK_L)毕赤酵母组成型高效分泌表达系统。[方法]人工合成MF-α信号肽与EK_L融合基因,克隆于pGAPzα-A和野生毕赤酵母X-33。镍柱纯化EK_L,内切糖苷酶H(
【机 构】
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广东药科大学生命科学与生物制药学院广东省生物技术候选药物重点实验室;
【基金项目】
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广东省科技计划项目(“基于EGFR二聚体界面靶向策略单克隆抗体抗瘤活性与作用机制研究”,No.2014A020210027);广东省自然科学基金项目(“靶向二聚化界面的新型抗EGFR单抗抑瘤活性和机制研究”,No.A2015230);广东高校省级重大科研项目(“基于EGFR二聚体界面靶向策略治疗性纳米抗体研制”,No.2016KZDXM042)
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[目的]构建牛肠激酶轻链(EK_L)毕赤酵母组成型高效分泌表达系统。[方法]人工合成MF-α信号肽与EK_L融合基因,克隆于pGAPzα-A和野生毕赤酵母X-33。镍柱纯化EK_L,内切糖苷酶H(Endo H)消化法鉴定糖基化,软件分析糖基化位点,以含EK_L位点的融合蛋白作底物验证酶学活性。[结果]获得了8株EK_L的高抗性毕赤酵母转化子,其中7株可组成型分泌表达目的蛋白,在摇瓶中表达水平约为20 mg/L。分析表明,EK_L表达产物为分子量约43 kDa的N型糖基化蛋白,可有效切割含识别位点的融合蛋白。[结论]成功构建了EK_L毕赤酵母组成型高效分泌表达系统。
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