论文部分内容阅读
摘要 [目的]对胆碱酯酶的保藏性进行研究分析，以期得到保障农药残留检测的最佳酶活力。[方法]试验选定高酶活力的大豆酯酶为酶原，通过筛选最适反应温度、反应时间、离子浓度和最适pH，及最佳的反应显色体系来确定反应最适的条件，采用不同的显色体系酶抑制法，研究酶片的制作方法。[结果]酶片载体材料采用硝酸纤维膜，制作每张酶片取20 μL大豆酶液，15 μL 0.5%的BSA溶液，2 μL 0.05%戊二醛于平底试管中。添加0.03 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液至总体积100 μL，4 ℃固定10 h；制作每张显色片，需在1 cm×1 cm大小的滤纸片上加入50 μL显色剂，30 μL底物，4 ℃冷风吹干，封膜真空保存。[结论] 固兰B盐和α-乙酸奈酯组合，适合作为酶抑制法检测有机磷农药残留的显色剂，且效果明显。
关键词 大豆；胆碱酯酶；农药残留；酶片
中图分类号 TS207.5+3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0081-04
Abstract [Objective]The preservation of cholinesterase was studied in order to guarantee the best enzyme activity of pesticide residue detection. [Method] The soybean esterase with high enzyme activity was selected as zymogen， optimum reaction conditions by screening the optimal reaction temperature， reaction time， concentration and pH， reaction and the best color system were determine.The method of making enzyme tablets was studied by using different color system and enzyme inhibition method.[Result]Nitrocellulose membrane was used for enzyme piece of material， which made each enzyme take 20 μL soybean enzyme liquid， 15 μL 0.5% BSA solution， 2 μL 0.05% glutaraldehyde to the bottom of the tube.Add 0.03 mol/L pH 7.0 phosphate buffer and the total volume was 100 μL， 4 ℃ fixed 10 h.Made each color piece， should add 50 μL chromogenic agent in 1 cm×1 cm filter size， 30 μL substrates， 4 ℃ cold wind blow dry， sealing membrane vacuum preservation. [Conclusion]The combination of solid blue B salt and αnaphthyl acetate is suitable for the detection of organophosphorus pesticide residue by enzyme inhibition method， and the effect is obvious.
Key words Soybean；Cholinesterase；Pesticide residues；Enzyme slices
農药残留是农药使用后一个时期内未被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水源、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称[1-2]。农药残留检测酶抑制法，是基于农药的毒性机理来进行测定的，农药在生物体内能与乙酰胆碱酯酶结合，且不易分离[3-4]，乙酰胆碱酯酶的活性受有机磷和氨基酸甲酸酯类农药的特异性抑制，丧失了水解底物的活力[5]，致使神经传导中的乙酰胆碱不能水解而积累，影响神经的信号、递质的正常传递，神经持续兴奋，发生抽搐等，导致昆虫中毒甚至死亡[6]。根据有机磷农药对酶促反应具有抑制作用这一毒理学特性，建立了酶抑制法检测农产品中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留[7-8]。其中由于植物酯酶的成本大大低于动物性的乙酰胆碱酯酶，且来源广泛易得，因此植物酯酶抑制法测定农药残留是一种很经济适用的方法[9-10]。该试验着重研究酶抑制法的关键工作酶——植物酯酶，从大豆中提取植物酯酶，将提取出来的植物胆碱酯酶固定到载体上，制作成快速检测酶片，提高酶活力，也探究提高植物酯酶的保藏期，解决胆碱酯酶难以保存的问题，用于农药残留的快速现场检测。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料与主要试剂。
东北大豆，购自天津红旗农贸市场；α-乙酸奈酯，天津伞科技有限责任公司；硝酸纤维膜（NC），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；牛血清白蛋白（BSA），Ruibio分装，合肥博美生物科技有限责任公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、丙酮、戊二醛、苯，均为分析纯，购自天津市化学试剂三厂；氧乐果，天津京津农药厂。
1.1.2 主要仪器设备。
JJ-2型组织捣碎匀浆机，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；EX224电子天平，奥豪仪器（上海）有限公司；国华SHZ-82恒温振荡器，常州国华电器有限公司；LD5-2B低速离心机，北京雷勃尔离心机有限公司；722N可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；LGJ-18S冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司。
关键词 大豆；胆碱酯酶；农药残留；酶片
中图分类号 TS207.5+3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0081-04
Abstract [Objective]The preservation of cholinesterase was studied in order to guarantee the best enzyme activity of pesticide residue detection. [Method] The soybean esterase with high enzyme activity was selected as zymogen， optimum reaction conditions by screening the optimal reaction temperature， reaction time， concentration and pH， reaction and the best color system were determine.The method of making enzyme tablets was studied by using different color system and enzyme inhibition method.[Result]Nitrocellulose membrane was used for enzyme piece of material， which made each enzyme take 20 μL soybean enzyme liquid， 15 μL 0.5% BSA solution， 2 μL 0.05% glutaraldehyde to the bottom of the tube.Add 0.03 mol/L pH 7.0 phosphate buffer and the total volume was 100 μL， 4 ℃ fixed 10 h.Made each color piece， should add 50 μL chromogenic agent in 1 cm×1 cm filter size， 30 μL substrates， 4 ℃ cold wind blow dry， sealing membrane vacuum preservation. [Conclusion]The combination of solid blue B salt and αnaphthyl acetate is suitable for the detection of organophosphorus pesticide residue by enzyme inhibition method， and the effect is obvious.
Key words Soybean；Cholinesterase；Pesticide residues；Enzyme slices
農药残留是农药使用后一个时期内未被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水源、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称[1-2]。农药残留检测酶抑制法，是基于农药的毒性机理来进行测定的，农药在生物体内能与乙酰胆碱酯酶结合，且不易分离[3-4]，乙酰胆碱酯酶的活性受有机磷和氨基酸甲酸酯类农药的特异性抑制，丧失了水解底物的活力[5]，致使神经传导中的乙酰胆碱不能水解而积累，影响神经的信号、递质的正常传递，神经持续兴奋，发生抽搐等，导致昆虫中毒甚至死亡[6]。根据有机磷农药对酶促反应具有抑制作用这一毒理学特性，建立了酶抑制法检测农产品中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留[7-8]。其中由于植物酯酶的成本大大低于动物性的乙酰胆碱酯酶，且来源广泛易得，因此植物酯酶抑制法测定农药残留是一种很经济适用的方法[9-10]。该试验着重研究酶抑制法的关键工作酶——植物酯酶，从大豆中提取植物酯酶，将提取出来的植物胆碱酯酶固定到载体上，制作成快速检测酶片，提高酶活力，也探究提高植物酯酶的保藏期，解决胆碱酯酶难以保存的问题，用于农药残留的快速现场检测。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料与主要试剂。
东北大豆，购自天津红旗农贸市场；α-乙酸奈酯，天津伞科技有限责任公司；硝酸纤维膜（NC），北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；牛血清白蛋白（BSA），Ruibio分装，合肥博美生物科技有限责任公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、丙酮、戊二醛、苯，均为分析纯，购自天津市化学试剂三厂；氧乐果，天津京津农药厂。
1.1.2 主要仪器设备。
JJ-2型组织捣碎匀浆机，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；EX224电子天平，奥豪仪器（上海）有限公司；国华SHZ-82恒温振荡器，常州国华电器有限公司；LD5-2B低速离心机，北京雷勃尔离心机有限公司；722N可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；LGJ-18S冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司。