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摘要 为了解甘肃省大麦条纹病病原菌Pyrenophora graminea的遗传多样性及致病力差异，运用RAPD分子标记技术对大麦条纹病菌不同菌株进行遗传多样性分析，并采用三明治法进行菌株致病力差异研究。结果表明：17个RAPD标记从45个菌株中扩增出126条带，平均每个标记7.41条带，遗传相似系数范围为0.468 3～0.984 1，平均值为0.830 8，当遗传相似系数为0.723 6时，可将供试菌株划分为4个类群，分别包含41、2、1和1个菌株;致病力测定结果显示菌株QWC较菌株QQ致病力强，两菌株除在品种‘甘啤2号’和‘GP3’上无致病力外，在其他供试品种上致病力均存在差异。表明大麦条纹病菌不同菌株间存在遗传差异，且菌株QWC和菌株QQ存在致病力差异。
关键词 大麦条纹病菌; 随机扩增多态性DNA; 遗传多样性; 致病力差异
中图分类号： S 435.123
文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018287
Abstract The genetic diversity of Pyrenophora graminea collected from different regions in Gansu， was detected with RAPD markers， and the virulence difference between isolate QQ and isolate QWC was tested by the sandwich method. The results showed that a total of 126 fragments were obtained from 45 isolates. Among them， all of the fragments were polymorphic， with an average of 7.41 fragments per RAPD marker. The genetic similarity ranged from 0.468 3 to 0.984 1， with the average of 0.830 8. Isolates in the study were classified into 4 groups at a genetic similarity level of 0.723 6. Virulence test showed that isolate QWC had higher virulence than isolate QQ， and isolate QWC and isolate QQ had virulence difference on all barley varieties except ‘Ganpi 2’ and ‘GP3’， which were immune to isolate QWC and isolate QQ. The results indicated that there was genetic difference among 45 isolates and a clear virulence differentiation between isolate QWC and isolate QQ.
Key words Pyrenophora graminea; RAPD; genetic diversity; virulence differentiation
大麥作为全球第四大禾谷类作物，与其他麦类作物相比，其抗旱、耐瘠和耐盐性更强，在全世界广泛种植，而我国大麦贸易长期处于净进口状态[1]。经过育种工作者多年的努力，目前已经育成部分品种，缓解了我国啤酒大麦市场的供求矛盾。随着我国人均啤酒消费量的上升、人口的增加以及大麦粮草双高育种目标的提出，对啤用大麦需求进一步加大，但我国大麦生产和发展过程受到大麦条纹病（barley leaf stripe）的影响，该病害是由麦类核腔菌Pyrenophora graminea （anamorph Drechslera graminea）[（Rabenh. ex. Schlech.）Shoemaker]引起的种传病害，在大多数大麦种植地区发生严重，导致大麦严重减产[23]。大麦条纹病主要发生在北美、北非、俄罗斯、欧洲、印度和中国等。国内该病害主要分布在沿长江流域的浙江、江苏、四川、甘肃河西走廊地区以及青藏高原裸大麦区等。近年来大麦条纹病在我国江苏、浙江、四川和湖北等地的重病区平均发病率高达35.3%[4]，河西走廊玉门市发病率达60%，造成30%～40%的产量损失[5]，甘肃省古浪县重病田块发病率达到27%[6]。
大麦条纹病菌遗传多样性分析国内外已有报道，Jawhar等[7]运用12个随机引物对来自叙利亚不同地区的大麦条纹病菌进行RAPD分析，结果表明不同菌株间有明显遗传差异;王春明等[8]运用10个随机引物对甘肃省的11个大麦条纹病菌标样进行RAPD分析，11个供试菌株间遗传距离为0.02～0.31。Bayraktar等[9]对采自不同地区大麦条纹病菌进行ITSRFLP和ISSR分析，ITSRFLP结果显示供试菌株间无差异，而ISSR分析显示供试菌株可划分为4个簇。司二静等[10]利用ISSR标记对甘肃省不同地区的大麦条纹病菌进行遗传多样性分析，结果表明90.24%的片段具有多态性，遗传相似系数为0.44～1，当遗传相似系数为0.68时，可将供试菌株划分为4个类群。
抗病育种是病害防治经济有效的途径，抗性评价是抗病育种的前提条件，而不同菌株间致病力差异给抗性评价带来了很大困扰，只有在明确菌株间致病力差异的基础上才有可能获得准确的抗性评价，国内外关于大麦抗条纹病菌致病力差异已有报道，Tekauz[11]评价了3个菌株对57份大麦品种进行抗性评价，结果表明3个菌株在致病力上存在显著差异，WRS1237致病力最强而WRS1238致病力最弱。Gatti等[12]依据菌丝生长速率、致病力和蛋白类型进行群体变异分析，将供试菌株划分成无致病力、中等致病力和强致病力，且不同致病力的类群拥有不同的蛋白类型。Bayraktar等[9]在48个大麦品种上对13个菌株进行致病力变异分析，结果显示菌株存在很高的致病力变异。吴宽然[13]通过对13个菌株的侵染调查分析，发现各个菌株间的致病力差异较大。司二静等[10]采用三明治法对43个大麦条纹病菌进行致病力差异研究，其中强致病力、中等致病力和弱致病力菌株分别为2个、21个和20个，表明不同菌株间存在明显致病力差异。目前关于甘肃省大麦条纹病菌在不同品种上的致病力差异研究还未见报道。 本研究对来源于甘肃省不同地区、不同年份的大麦条纹病菌运用RAPD标记进行遗传多样性分析，并通过三明治法接种不同大麦品种进行菌株间致病力差异研究，以期为深入开展该病害的流行规律和抗病育种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株：45个Pyrenophora graminea菌株由甘肃省干旱生境作物学重点实验室麦类种质创新课题组提供，菌株详细信息见表1。
1.2 方法
1.2.1 45个大麦条纹病菌菌株RAPD分析
不同菌株DNA的提取参考改良CTAB法[910，14]。RAPD引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，菌株间表现多态性的引物信息见表2。PCR扩增体系为10 μL：2×Master Mix 5 μL、10 μmoL/L引物1 μL、60 ng/μL模板1 μL，加ddH2O至10 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s;37℃ 退火30s;72℃延伸2 min，共35个循环;72℃延伸10 min，4℃保存，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 大麦条纹病菌菌株QWC和QQ的致病力测定
致病力测定方法采用三明治法[10，15]，将菌株QWC和QQ分别在PDA培养基上培养7 d，在菌落边缘打取菌饼，置于新PDA培养基上，在22℃下恒温培养7 d，用来接种大麦种子。
种子用70%乙醇处理30 s，再用5%次氯酸钠处理5 min，经无菌水冲洗多次后将种子彻底晾干，然后将种子置于生长7 d的两层菌丝的PDA培养基中间，每个重复接种30粒大麦种子，每个品种3次重复，6℃黑暗放置20 d后转移至直径12 cm花盆，L∥D=12 h∥12 h，培养45 d后待病斑完全显现时进行观察记载每次重复的全部幼苗数，及出现症状的幼苗数。
1.3 数据分析
将电泳结果DNA图谱中清晰且可重复的条带记为“1”，无条带记为“0”，利用软件NTSYSpc 2.10e计算各菌株间遗传相似性系数（genetic similarity，GS），采用UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）法进行聚类分析。
致病力划分参照Bayraktar 等[9]：发病率
关键词 大麦条纹病菌; 随机扩增多态性DNA; 遗传多样性; 致病力差异
中图分类号： S 435.123
文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018287
Abstract The genetic diversity of Pyrenophora graminea collected from different regions in Gansu， was detected with RAPD markers， and the virulence difference between isolate QQ and isolate QWC was tested by the sandwich method. The results showed that a total of 126 fragments were obtained from 45 isolates. Among them， all of the fragments were polymorphic， with an average of 7.41 fragments per RAPD marker. The genetic similarity ranged from 0.468 3 to 0.984 1， with the average of 0.830 8. Isolates in the study were classified into 4 groups at a genetic similarity level of 0.723 6. Virulence test showed that isolate QWC had higher virulence than isolate QQ， and isolate QWC and isolate QQ had virulence difference on all barley varieties except ‘Ganpi 2’ and ‘GP3’， which were immune to isolate QWC and isolate QQ. The results indicated that there was genetic difference among 45 isolates and a clear virulence differentiation between isolate QWC and isolate QQ.
Key words Pyrenophora graminea; RAPD; genetic diversity; virulence differentiation
大麥作为全球第四大禾谷类作物，与其他麦类作物相比，其抗旱、耐瘠和耐盐性更强，在全世界广泛种植，而我国大麦贸易长期处于净进口状态[1]。经过育种工作者多年的努力，目前已经育成部分品种，缓解了我国啤酒大麦市场的供求矛盾。随着我国人均啤酒消费量的上升、人口的增加以及大麦粮草双高育种目标的提出，对啤用大麦需求进一步加大，但我国大麦生产和发展过程受到大麦条纹病（barley leaf stripe）的影响，该病害是由麦类核腔菌Pyrenophora graminea （anamorph Drechslera graminea）[（Rabenh. ex. Schlech.）Shoemaker]引起的种传病害，在大多数大麦种植地区发生严重，导致大麦严重减产[23]。大麦条纹病主要发生在北美、北非、俄罗斯、欧洲、印度和中国等。国内该病害主要分布在沿长江流域的浙江、江苏、四川、甘肃河西走廊地区以及青藏高原裸大麦区等。近年来大麦条纹病在我国江苏、浙江、四川和湖北等地的重病区平均发病率高达35.3%[4]，河西走廊玉门市发病率达60%，造成30%～40%的产量损失[5]，甘肃省古浪县重病田块发病率达到27%[6]。
大麦条纹病菌遗传多样性分析国内外已有报道，Jawhar等[7]运用12个随机引物对来自叙利亚不同地区的大麦条纹病菌进行RAPD分析，结果表明不同菌株间有明显遗传差异;王春明等[8]运用10个随机引物对甘肃省的11个大麦条纹病菌标样进行RAPD分析，11个供试菌株间遗传距离为0.02～0.31。Bayraktar等[9]对采自不同地区大麦条纹病菌进行ITSRFLP和ISSR分析，ITSRFLP结果显示供试菌株间无差异，而ISSR分析显示供试菌株可划分为4个簇。司二静等[10]利用ISSR标记对甘肃省不同地区的大麦条纹病菌进行遗传多样性分析，结果表明90.24%的片段具有多态性，遗传相似系数为0.44～1，当遗传相似系数为0.68时，可将供试菌株划分为4个类群。
抗病育种是病害防治经济有效的途径，抗性评价是抗病育种的前提条件，而不同菌株间致病力差异给抗性评价带来了很大困扰，只有在明确菌株间致病力差异的基础上才有可能获得准确的抗性评价，国内外关于大麦抗条纹病菌致病力差异已有报道，Tekauz[11]评价了3个菌株对57份大麦品种进行抗性评价，结果表明3个菌株在致病力上存在显著差异，WRS1237致病力最强而WRS1238致病力最弱。Gatti等[12]依据菌丝生长速率、致病力和蛋白类型进行群体变异分析，将供试菌株划分成无致病力、中等致病力和强致病力，且不同致病力的类群拥有不同的蛋白类型。Bayraktar等[9]在48个大麦品种上对13个菌株进行致病力变异分析，结果显示菌株存在很高的致病力变异。吴宽然[13]通过对13个菌株的侵染调查分析，发现各个菌株间的致病力差异较大。司二静等[10]采用三明治法对43个大麦条纹病菌进行致病力差异研究，其中强致病力、中等致病力和弱致病力菌株分别为2个、21个和20个，表明不同菌株间存在明显致病力差异。目前关于甘肃省大麦条纹病菌在不同品种上的致病力差异研究还未见报道。 本研究对来源于甘肃省不同地区、不同年份的大麦条纹病菌运用RAPD标记进行遗传多样性分析，并通过三明治法接种不同大麦品种进行菌株间致病力差异研究，以期为深入开展该病害的流行规律和抗病育种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株：45个Pyrenophora graminea菌株由甘肃省干旱生境作物学重点实验室麦类种质创新课题组提供，菌株详细信息见表1。
1.2 方法
1.2.1 45个大麦条纹病菌菌株RAPD分析
不同菌株DNA的提取参考改良CTAB法[910，14]。RAPD引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，菌株间表现多态性的引物信息见表2。PCR扩增体系为10 μL：2×Master Mix 5 μL、10 μmoL/L引物1 μL、60 ng/μL模板1 μL，加ddH2O至10 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s;37℃ 退火30s;72℃延伸2 min，共35个循环;72℃延伸10 min，4℃保存，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 大麦条纹病菌菌株QWC和QQ的致病力测定
致病力测定方法采用三明治法[10，15]，将菌株QWC和QQ分别在PDA培养基上培养7 d，在菌落边缘打取菌饼，置于新PDA培养基上，在22℃下恒温培养7 d，用来接种大麦种子。
种子用70%乙醇处理30 s，再用5%次氯酸钠处理5 min，经无菌水冲洗多次后将种子彻底晾干，然后将种子置于生长7 d的两层菌丝的PDA培养基中间，每个重复接种30粒大麦种子，每个品种3次重复，6℃黑暗放置20 d后转移至直径12 cm花盆，L∥D=12 h∥12 h，培养45 d后待病斑完全显现时进行观察记载每次重复的全部幼苗数，及出现症状的幼苗数。
1.3 数据分析
将电泳结果DNA图谱中清晰且可重复的条带记为“1”，无条带记为“0”，利用软件NTSYSpc 2.10e计算各菌株间遗传相似性系数（genetic similarity，GS），采用UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）法进行聚类分析。
致病力划分参照Bayraktar 等[9]：发病率