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【摘要】:目的:建立板蓝根颗粒中靛玉红的含量测定方法,为板蓝根颗粒的质量标准控制提供理论依据。方法:采用LC-10ATvp高效液相色谱仪,色谱柱:Diamonsil C18柱(4.6mm×250mm,10μm);流动相:甲醇:0.2%醋酸溶液(73:27);流速:1.0ml/min;检测波长:289nm;柱温:25℃;进样量:20μl。结果:靛玉红进样量在5.28～26.40μg范围内与峰面积呈良好线性关系,R=0.9935;平均回收率为100.67%,RSD=1.31%。结论:本实验所建立的方法专属性强,准确度高,重现性好,可作为板蓝根颗粒的质量控制方法。
【关键词】:RP-HPLC;板蓝根颗粒;靛玉红
【中图分类号】R927.1【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)06-078-2
Study on Content Measurement of Indirubin in Banlangen Granules by RP-HPLC
【Abstract】:Objective:To establish a method for extracting of measuring the content of indirubin in banlangen granules by RP-HPLC,in order to provide theoretical basis for the quality standards of banlangen granules. Methods:The content measurement of indirubin in banlangen granules by RP-HPLC,LC-10ATvp high-performance liquid chromatograph,Columns Diamonsil - C18(4.6mm×150mm,10μm),mobile phase:methanol:0.2% acetic acid solution(73:27);flow rate:1.0ml/min;detection wavelength:289nm;column temperature:25℃;injection volume 20μl. Results:The indirubin within the range of 5.28～26.40μg peak area was linear,R=0.9935;The average recovery was 100.67%,RSD=1.31%. Conclusion:The established method has strong specificity,high accuracy and good reproducibility,it can be used as quality control of banlangen granules.
【Key words】:RP-HPLC;Banlangen Granules; indirubin
板蓝根颗粒是以十字花科植物菘蓝(Isatisindigotica
Fort)为原料制成的单味制剂,为《中国药典》(2005版)收载品种,具有清热解毒,凉血利咽,消肿的功效,而靛玉红是板蓝根中抑菌的主要活性成份,尤其靛玉红是板蓝根中治疗慢性粒细胞白血病的有效成份之一[1-2]。临床用于治疗肺胃热盛所致的咽喉肿痛,口咽干燥,腮部肿胀,急性扁桃体炎,腮腺炎,防治传染性肝炎,小儿麻疹等病症[3-4]。
1仪器和试药
1.1主要仪器LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津),SPD-10A检测器(日本岛津),FA1004型电子天平(上海精科天平仪器厂),KS-600D超声波清洗机(宁波海曙科生超声设备有限公司);ZK-82A型真空干燥箱(上海市实验仪器总厂);TDL-40B台式离心机(上海安亭科学仪器厂);电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
1.2试药对照品靛玉红(中国药品生物制品检定所,批号200204);甲醇为色谱纯,氯仿为分析纯,水为蒸馏水;板蓝根颗粒为市售(山西康意制药有限公司生产,批号为20080802、20080803、20080805)、(安徽华佗国药厂生产,批号为20080419、20080420、20080421)。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备精密称取靛玉红对照品6.6mg于50ml容量瓶中,加甲醇适量至刻度线,超声15min,制备成浓度为0.132mg/ml的对照品溶液,放入-4℃冰箱贮存,备用。
2.2样品溶液的制备称取板蓝根颗粒适量,研细,称取1g置具塞锥形瓶中,加氯仿50ml,超声处理20分钟,80℃水浴回流60分钟,过滤,将滤液蒸干,残渣用甲醇定量移至10ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度线,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
2.3色谱条件与系统适用性试验[4]色谱柱:Diamonsil C18柱(4.6mm×250mm,10μm);流动相:甲醇:0.2%醋酸溶液(73:27);流速:1.0ml/min;检测波长:289nm;柱温:25℃;进样量:20μl。在此色谱条件下,靛玉红色谱峰达到基线分离。
2.4线性关系的考察分别精密吸取对照品溶液0.4,0.8,1.2,1.6,2.0ml置于10ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度线,摇匀,配制成不同浓度的对照品贮备液,分别精密吸取上述对照品贮备液20μl,分别进样测定,以峰面积为纵坐标(Y),以质量浓度(μg/ml)为横坐标(X)进行线性回归,得到线性方程为:Y=244332X-133383,R=0.9935,靛玉红进样量在5.28～26.40μg范围内与峰面积呈良好线性关系。
2.5精密度实验按“2.1”项下方法配制对照品溶液(质量浓度为15.84μg/ml),精密吸取20μl,重复进样5次,
结果靛玉红峰面积的RSD=1.49%(n=5),表明仪器精密度良好。
(下转第80页)
(上接第78页)
2.6稳定性试验精密吸取同一样品溶液适量,在室温下放置,在0,5,10,12,24小时分别进样,测定峰面积。结果RSD=1.64%(n=5),表明樣品溶液在24 h内稳定性良好。
2.7重复性实验取同一批号的板蓝根颗粒样品5份,按“2.2”项下方法制备样品溶液,按上述色谱条件进行测定,记录色谱图,计算靛玉红的含量。结果靛玉红含量的RSD=
0.52%,表明本实验方法重现性良好。
2.8加样回收率试验精密称取已知含量的板蓝根颗粒样品粉末6份适量,分别加入靛玉红对照品适量,置具塞锥形瓶中,按“2.2”项下方法制备溶液,按上述色谱条件测定,平均回收率为100.67%,RSD=1.31%(n=6)。表明本方法的回收率较好,结果见表1。
2.9样品含量测定取不同批号板蓝根颗粒样品,按“2.2”项下方法制备样品溶液,按上述设定的色谱条件测定样品中靛玉红的含量,平均含量分别为60.40μg/袋、61.25μg/袋、60.75μg/袋、57.10μg/袋(n=5)。
表2 板蓝根颗粒中靛玉红含量测定结果(n=5)
批号 样品中靛玉红含量(μg/g) 样品中靛玉红含量(μg/袋)
20080802 12.08 60.40
20080803 12.25 61.25
20080805 12.15 60.75
20080419 11.42 57.10
20080420 11.94 59.70
20080421 11.84 59.20
3讨论
由于板蓝根颗粒中的靛玉红含量非常低,为使靛玉红从颗粒剂中充分溶解提取出来,我们在实验中曾试用过以下方法提取制备供试品溶液:①50ml热水溶解后用氯仿萃取4次,每次30ml;②40ml热水溶解加入20ml饱和无水硫酸钠溶液后用乙醚萃取4次,每次40ml;③浸泡15小时,用索氏提取器回流提取8小时;④用乙酸乙酯回流2个小时。经测定上述方法提取的溶液,靛玉红含量均较低;经分析改进,采用氯仿作溶剂超声处理20分钟后回流60分钟。该方法提取的板蓝根颗粒中的靛玉红较为完全,且操作简单易行。
试验中曾试用过多种流动相,如甲醇:水(62:38),甲醇:水(75:25),甲醇:0.1%醋酸溶液(73:27),甲醇:0.1%磷酸溶液(60:40)等,以本文所述流動相,即甲醇:0.2%醋酸溶液(73:27),分离效果最佳,且出峰稳定,峰形较好,保留时间适宜。
本实验所测定的二个厂家生产的板蓝根颗粒中靛玉红的含量相差不大,说明该实验所用的方法对这二个厂家的板蓝根颗粒中靛玉红的含量测定具有可行性。
总之,通过本实验建立了板蓝根颗粒中靛玉红含量测定的RP-HPLC测定方法,该法操作重复性良好,测定结果稳定可靠,因此,该方法能应用于板蓝根颗粒的质量控制。
参考文献
[1] 安益强,贾晓斌,陈彦等.RP-HPLC测定不同厂家板蓝根颗粒中表告依春的含量[J].中华中医药杂志,2009,24(4):529-531.
[2] 陈勇,李祥,陈建伟,等.HPLC法测定板蓝根颗粒中直铁线莲宁B和异落叶松脂素的含量[J].现代中药研究与实践,2009,22(6):53-55.
[3] 李向阳,屠万倩,李振国,等.HPLC法测定复方板蓝根颗粒中靛玉红的含量[J].中医研究,2005,18(7):18-19.
[4] 程力惠.板蓝根中靛玉红提取方法研究[J].亚热带植物科学,2005,34(2):46-47.
【关键词】:RP-HPLC;板蓝根颗粒;靛玉红
【中图分类号】R927.1【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)06-078-2
Study on Content Measurement of Indirubin in Banlangen Granules by RP-HPLC
【Abstract】:Objective:To establish a method for extracting of measuring the content of indirubin in banlangen granules by RP-HPLC,in order to provide theoretical basis for the quality standards of banlangen granules. Methods:The content measurement of indirubin in banlangen granules by RP-HPLC,LC-10ATvp high-performance liquid chromatograph,Columns Diamonsil - C18(4.6mm×150mm,10μm),mobile phase:methanol:0.2% acetic acid solution(73:27);flow rate:1.0ml/min;detection wavelength:289nm;column temperature:25℃;injection volume 20μl. Results:The indirubin within the range of 5.28～26.40μg peak area was linear,R=0.9935;The average recovery was 100.67%,RSD=1.31%. Conclusion:The established method has strong specificity,high accuracy and good reproducibility,it can be used as quality control of banlangen granules.
【Key words】:RP-HPLC;Banlangen Granules; indirubin
板蓝根颗粒是以十字花科植物菘蓝(Isatisindigotica
Fort)为原料制成的单味制剂,为《中国药典》(2005版)收载品种,具有清热解毒,凉血利咽,消肿的功效,而靛玉红是板蓝根中抑菌的主要活性成份,尤其靛玉红是板蓝根中治疗慢性粒细胞白血病的有效成份之一[1-2]。临床用于治疗肺胃热盛所致的咽喉肿痛,口咽干燥,腮部肿胀,急性扁桃体炎,腮腺炎,防治传染性肝炎,小儿麻疹等病症[3-4]。
1仪器和试药
1.1主要仪器LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津),SPD-10A检测器(日本岛津),FA1004型电子天平(上海精科天平仪器厂),KS-600D超声波清洗机(宁波海曙科生超声设备有限公司);ZK-82A型真空干燥箱(上海市实验仪器总厂);TDL-40B台式离心机(上海安亭科学仪器厂);电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
1.2试药对照品靛玉红(中国药品生物制品检定所,批号200204);甲醇为色谱纯,氯仿为分析纯,水为蒸馏水;板蓝根颗粒为市售(山西康意制药有限公司生产,批号为20080802、20080803、20080805)、(安徽华佗国药厂生产,批号为20080419、20080420、20080421)。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备精密称取靛玉红对照品6.6mg于50ml容量瓶中,加甲醇适量至刻度线,超声15min,制备成浓度为0.132mg/ml的对照品溶液,放入-4℃冰箱贮存,备用。
2.2样品溶液的制备称取板蓝根颗粒适量,研细,称取1g置具塞锥形瓶中,加氯仿50ml,超声处理20分钟,80℃水浴回流60分钟,过滤,将滤液蒸干,残渣用甲醇定量移至10ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度线,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
2.3色谱条件与系统适用性试验[4]色谱柱:Diamonsil C18柱(4.6mm×250mm,10μm);流动相:甲醇:0.2%醋酸溶液(73:27);流速:1.0ml/min;检测波长:289nm;柱温:25℃;进样量:20μl。在此色谱条件下,靛玉红色谱峰达到基线分离。
2.4线性关系的考察分别精密吸取对照品溶液0.4,0.8,1.2,1.6,2.0ml置于10ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度线,摇匀,配制成不同浓度的对照品贮备液,分别精密吸取上述对照品贮备液20μl,分别进样测定,以峰面积为纵坐标(Y),以质量浓度(μg/ml)为横坐标(X)进行线性回归,得到线性方程为:Y=244332X-133383,R=0.9935,靛玉红进样量在5.28～26.40μg范围内与峰面积呈良好线性关系。
2.5精密度实验按“2.1”项下方法配制对照品溶液(质量浓度为15.84μg/ml),精密吸取20μl,重复进样5次,
结果靛玉红峰面积的RSD=1.49%(n=5),表明仪器精密度良好。
(下转第80页)
(上接第78页)
2.6稳定性试验精密吸取同一样品溶液适量,在室温下放置,在0,5,10,12,24小时分别进样,测定峰面积。结果RSD=1.64%(n=5),表明樣品溶液在24 h内稳定性良好。
2.7重复性实验取同一批号的板蓝根颗粒样品5份,按“2.2”项下方法制备样品溶液,按上述色谱条件进行测定,记录色谱图,计算靛玉红的含量。结果靛玉红含量的RSD=
0.52%,表明本实验方法重现性良好。
2.8加样回收率试验精密称取已知含量的板蓝根颗粒样品粉末6份适量,分别加入靛玉红对照品适量,置具塞锥形瓶中,按“2.2”项下方法制备溶液,按上述色谱条件测定,平均回收率为100.67%,RSD=1.31%(n=6)。表明本方法的回收率较好,结果见表1。
2.9样品含量测定取不同批号板蓝根颗粒样品,按“2.2”项下方法制备样品溶液,按上述设定的色谱条件测定样品中靛玉红的含量,平均含量分别为60.40μg/袋、61.25μg/袋、60.75μg/袋、57.10μg/袋(n=5)。
表2 板蓝根颗粒中靛玉红含量测定结果(n=5)
批号 样品中靛玉红含量(μg/g) 样品中靛玉红含量(μg/袋)
20080802 12.08 60.40
20080803 12.25 61.25
20080805 12.15 60.75
20080419 11.42 57.10
20080420 11.94 59.70
20080421 11.84 59.20
3讨论
由于板蓝根颗粒中的靛玉红含量非常低,为使靛玉红从颗粒剂中充分溶解提取出来,我们在实验中曾试用过以下方法提取制备供试品溶液:①50ml热水溶解后用氯仿萃取4次,每次30ml;②40ml热水溶解加入20ml饱和无水硫酸钠溶液后用乙醚萃取4次,每次40ml;③浸泡15小时,用索氏提取器回流提取8小时;④用乙酸乙酯回流2个小时。经测定上述方法提取的溶液,靛玉红含量均较低;经分析改进,采用氯仿作溶剂超声处理20分钟后回流60分钟。该方法提取的板蓝根颗粒中的靛玉红较为完全,且操作简单易行。
试验中曾试用过多种流动相,如甲醇:水(62:38),甲醇:水(75:25),甲醇:0.1%醋酸溶液(73:27),甲醇:0.1%磷酸溶液(60:40)等,以本文所述流動相,即甲醇:0.2%醋酸溶液(73:27),分离效果最佳,且出峰稳定,峰形较好,保留时间适宜。
本实验所测定的二个厂家生产的板蓝根颗粒中靛玉红的含量相差不大,说明该实验所用的方法对这二个厂家的板蓝根颗粒中靛玉红的含量测定具有可行性。
总之,通过本实验建立了板蓝根颗粒中靛玉红含量测定的RP-HPLC测定方法,该法操作重复性良好,测定结果稳定可靠,因此,该方法能应用于板蓝根颗粒的质量控制。
参考文献
[1] 安益强,贾晓斌,陈彦等.RP-HPLC测定不同厂家板蓝根颗粒中表告依春的含量[J].中华中医药杂志,2009,24(4):529-531.
[2] 陈勇,李祥,陈建伟,等.HPLC法测定板蓝根颗粒中直铁线莲宁B和异落叶松脂素的含量[J].现代中药研究与实践,2009,22(6):53-55.
[3] 李向阳,屠万倩,李振国,等.HPLC法测定复方板蓝根颗粒中靛玉红的含量[J].中医研究,2005,18(7):18-19.
[4] 程力惠.板蓝根中靛玉红提取方法研究[J].亚热带植物科学,2005,34(2):46-47.