【摘 要】
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目的 通过导入人端粒酶逆转录酶(hTE RT)基因构建永生化人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC-hTERT),探索永生化HUVEC对汉滩病毒(HTNV)感染效率及细胞固有免疫调控的影响,评价HUVEC-hTERT作为研究HTNV细胞模型的潜能.方法 将hTERT基因克隆入慢病毒载体,构建pCDH-CMV-hTERT-EF1-puro质粒后包装慢病毒并感染HUVEC;嘌呤霉素筛选稳定表达hTERT基因的HUVEC命名为HUVEC-hTERT;利用显微镜观察和免疫荧光细胞化学染色法对HUVEC-hTERT的形态
【机 构】
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空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室,陕西西安710032;空军军医大学基础医学院学员三大队十一队,陕西西安710032
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目的 通过导入人端粒酶逆转录酶(hTE RT)基因构建永生化人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC-hTERT),探索永生化HUVEC对汉滩病毒(HTNV)感染效率及细胞固有免疫调控的影响,评价HUVEC-hTERT作为研究HTNV细胞模型的潜能.方法 将hTERT基因克隆入慢病毒载体,构建pCDH-CMV-hTERT-EF1-puro质粒后包装慢病毒并感染HUVEC;嘌呤霉素筛选稳定表达hTERT基因的HUVEC命名为HUVEC-hTERT;利用显微镜观察和免疫荧光细胞化学染色法对HUVEC-hTERT的形态及内皮细胞标志分子人血管性假血友病因子(vWF)、CD31和血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-cadherin)进行鉴定;利用免疫荧光法检测HTNV感染后核衣壳蛋白(NP)阳性细胞百分比,观察HTNV对HUVEC和HUVEC-hTERT的感染效率差异;利用实时定量PCR和Western blot法分别检测感染HTNV后,病毒基因组小片段(S)及其编码的NP在不同时间点的复制水平,验证HTNV在细胞中的增殖效率;利用实时定量PCR检测细胞β干扰素(IFN-β)、黏病毒抗性蛋白A(MxA)、MxB、干扰素诱导蛋白2(IFIT2)、干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)及炎症因子环加氧酶2(COX2)、细胞间黏附因子(ICAM)和CC趋化因子配体5(CCL5)的mRNA水平并利用Western blot法检测IFIT2、IFITM3和MxA的蛋白水平,观察细胞固有免疫对HTNV的反应是否一致.利用Western blot、实时定量PCR检测感染HTNV后细胞上述分子的表达情况,观察永生化后细胞固有免疫对HTNV的反应是否一致.结果 成功筛选出永生化细胞系HUVEC-hTERT,鉴定出其与HUVEC具有相同的表型并表达内皮细胞标志分子vWF、CD31、VE-cadherin;HUVEC-hTERT和HUVEC均可被HTNV感染且感染效率基本相同;在HTNV感染过程中,HUVEC-hTERT的固有免疫分子,如IFN-β、MxA、MxB、IFIT2、IFITM3、COX2、ICAM及CCL5的表达情况与HUVEC相同,表明HUVEC-hTERT固有免疫调控未发生改变.结论 HUVEC-hTERT可在一定程度上代替原代HUVEC用于HTNV感染致固有免疫应答调控的研究.
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