【摘 要】
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目的 构建人天然Fab段抗体库,并用从膀胱尿路上皮癌组织中提取纯化的gp96筛选抗gp96特异性抗体,为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法 .方法 取4个健康献血员新鲜血液各200 ml,分
【机 构】
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华北煤炭医学院病理教研室,天津医科大学第二医院
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目的 构建人天然Fab段抗体库,并用从膀胱尿路上皮癌组织中提取纯化的gp96筛选抗gp96特异性抗体,为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法 .方法 取4个健康献血员新鲜血液各200 ml,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,设计多对引物,以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA.轻链PCR产物和噬粒载体pComb3经Sac Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,由T4 DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,扩增后提取噬粒,构建轻链库.轻链库和重链Fd段PCR产物经Xho Ⅰ和Spe Ⅰ酶切,以同样方法 连接后转化XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13,产生噬菌体抗体全库.提取噬粒酶切鉴定轻链库和全库有无插入片段.分别以噬菌体全库和提取的噬粒为模板,以轻、重链不同引物组合进行PCR扩增.应用亲和层析和离子交换层析从膀胱癌组织中提取纯化gp96,并以此为抗原对构建的抗体库进行3轮筛选.结果 提取的淋巴细胞总RNA及逆转录合成的cDNA质量好,部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增.Fab全库库容达6.6×106,酶切和PCR显示有插入片段.用从膀胱尿路上皮癌组织中提取出的gp96进行3轮筛选,抗体库得到68倍的富集.结论 本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体、肿瘤免疫治疗打下基础.
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