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〔摘要〕 目的 通過网络药理学及分子对接方法预测四逆散治疗肠易激综合征（IBS）的分子作用机制。方法 通过TCMSP数据库筛选四逆散中所含药物的活性成分，应用GeneCards、DisGeNET、OMIM数据库预测和筛选与IBS的相关靶点。采用Omicshare平台对药物靶点和疾病相关靶点进行匹配映射，获得关键靶点。通过STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络。借助Cytoscape软件构建“药物-化合物-靶点-疾病”网络。应用GoEast数据库对四逆散治疗IBS的关键靶点进行GO分析，应用DAVID数据库进行KEGG通路分析。最后通过分子对接进一步验证结果的可靠性。结果 通过筛选，得到123个活性成分，共涉及245个作用靶点，与疾病靶点相关的活性成分有89个，主要通过调控IL-6、TNF等靶蛋白及IBS炎症过程中的Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路等发挥治疗作用。分子对接结果显示主要化合物与关键靶点具有较好的结合活性。结论 四逆散可能通过作用于免疫、炎症系统相关的蛋白靶点及通路起到治疗IBS的作用。
〔关键词〕 肠易激综合征;信号通路;四逆散;网络药理学;靶点;分子对接
〔中图分类号〕R259 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.015
Molecular Mechanism of Sini Powder in the Treatment of Irritable Bowel Syndrome
Based on the Analysis of Key Targets and Related Signal Pathways
LI Jiarong1， DENG Haixia2， CHEN Gengxin2*
（1. The Second Clinical School， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405， China;
2. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510120， China）
〔Abstract〕 Objective To predict the molecular mechanism of Sini Powder in treating irritable bowel syndrome （IBS） based on network pharmacology and molecular docking method. Methods The traditional Chinese medicine system pharmacology （TCMSP） was employed to screen the active ingredients of Sini Powder. GeneCards， DisGeNET and OMIM databases were used to predict and screen the disease-related targets of IBS. The Omicshare platform was employed to match the putative targets of ingredients and disease-related targets to obtain key targets. Then， protien-protien interaction network was constructed by using STRING database and the “medicine-chemical compound-targets-disease” network was constructed by using Cytoscape software. GoEast database was used to perform GO analysis on key targets of Sini Powder in the treatment of IBS， and DAVID database was used to perform KEGG pathway analysis. The reliability of the results was further verified by molecular docking. Results Through screening， 123 drug active ingredients were screened， involving a total of 245 targets and 89 of them related to IBS， mainly through the regulation of target proteins such as IL-6 and TNF and toll-like receptor signaling pathway and NF-κB signaling pathway in the process of IBS inflammation. The results of molecular docking showed that the main components had good binding with the key targets. Conclusion Sini Powder may play a role in the treatment of IBS through the role of immune， inflammation system related protein targets and pathways. 〔Keywords〕 irritable bowel syndrome; signal pathway; Sini Powder; network pharmacology; target; molecular docking
肠易激综合征（irritable bowel syndrome， IBS）是一种常见的功能性消化疾病，以反复腹痛和排便习惯改变为特征，常伴有腹胀、抑郁等症状。根据罗马Ⅳ诊断标准，亚洲国家的IBS发病率为5%～10%，且女性患病率高于男性[1]。IBS发病机制尚不明确，现被广泛认可的假说有胃肠道动力障碍、免疫与炎症、内脏超敏反应、脑-肠轴功能紊乱、肠道菌群失调、遗传易感性等，当前西医治疗手段有限，以基于症状的心理干预、饮食控制和药物控制为主，但效果不显著且易复发，而中医辨证论治在IBS治疗上有较大优势[2-3]。
IBS可根据其症状纳入中医学“泄泻”“肠郁”“腹痛”“郁证”等范畴，多与先天不足或后天失养、情志不调、饮食失节有关[1]。四逆散是张仲景《伤寒论·辨少阴病脉证并治》中的名方，由柴胡、白芍、枳实、甘草四味中药组成，其中，柴胡和甘草补脾体、疏肝气;枳实和白芍宣畅气机、散阴结，以达疏肝解郁、健脾止泻之效。因其配伍得当，疗效甚佳，在临床上被广泛应用于治疗各种消化系统疾病[4]。有学者对四逆散治疗IBS的综合疗效进行系统评价，分析结果显示四逆散加减治疗IBS的临床疗效优于西医常规疗法[5]。动物实验[6]发现，四逆散可以改善动物状态和肠道功能，进而治疗肝脾不调型IBS模型大鼠;还可通过降低肠道敏感性、降低血清5-羟色胺含量、改善胃肠电生理活动等机制治疗内脏高敏感性IBS模型大鼠。但目前关于四逆散治疗IBS的相关研究多集中在临床研究和动物实验方面，分子水平的作用机制探讨较为稀缺。
单味中药或组方均具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，而网络药理学正是以系统生物学为基础，从整体的角度系统地阐述疾病与药物之间的关系以及药物与机体之间相互作用的规律的研究方法。此外，从整体出发，更有利于全面揭示中药及中药方剂的药理作用和分子机制。最后，通过分子对接了解化合物与靶点结合的方式及结合稳定性，进一步验证结果的可靠性[7]。本文应用网络药理学及分子对接的方法，对四逆散治疗IBS的成分及靶点进行整理和分析，为了解其作用机制提供更全面的认知和更系统的帮助。
1 方法
1.1 药物药效成分及潜在作用靶点的收集
使用TCMSP平台（https：//www.tcmsp-e.com/）收集柴胡、白芍、枳实、甘草4味中药的化学成分，筛选口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18的化学成分作为四逆散中具有良好OB和DL的药效成分，同时结合文献研究及《中华人民共和国药典》[8]对四逆散所含药物中有明显药效成分的化合物进行补充，并分别找出这些成分对应的作用靶点、将得到的作用靶点通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）以物种为“Homo sapiens”进行筛选，获得与药效成分化合物相关的潜在作用靶点的蛋白信息。若化合物及其靶点未被收录在TCMSP中，则通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得SMILE格式，并导入SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点获取。
1.2 疾病相关靶点的收集
以“irritable bowel syndrome”为关键词，从DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）中查找IBS相关基因，其中，选取GeneCards数据库所得结果中relevance score≥30（relevance score是该数据库中用于评估基因与疾病相关性的指标，分數越大代表相关性越高）的基因纳入此次分析，同时将这批基因与DisGeNET、OMIM数据库所得结果进行合并，删除重复和假阳性的基因，得到与IBS的相关靶点。
1.3 潜在关键作用靶点的获取
通过Omicshare平台（https：//www.omicshare.com/），将四逆散药效成分的潜在作用靶点和IBS的相关靶点进行匹配映射，并绘制韦恩图获得四逆散治疗IBS的关键作用靶点。
1.4 蛋白-蛋白相互作用（protein protein interaction， PPI）网络的构建
把“1.3”中得到的关键作用靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/），研究物种设定为人，获得蛋白相互作用关系，将结果以PNG格式和TSV格式导出，并将结果导入Cytoscape 3.6.2（http：//www.cytoscape.org）软件制作PPI网络图。
1.5 药物-化合物-靶点-疾病网络的构建
使用Cytoscape构建“药物-活性成分-关键靶点-疾病”，网络中节点代表四逆散、药物活性成分的分子编码、关键靶点、疾病;网络中的边用来连接方剂中的药物与活性成分分子编码、活性成分分子编码与关键靶点、关键靶点与疾病。该网络将药物-化合物-靶点-疾病之间的关系可视化，并通过它剖析四逆散治疗IBS的作用机制。
1.6 关键靶点的通路注释和可视化分析
将关键靶点通过GoEast（http：//omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/）进行GO富集分析;应用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）进行KEGG通路富集分析。GO分析结果包括生物学过程（biological process， BP）的内容，取BP P值最小的10条条目制作气泡图。将KEGG富集分析结果取P值最小的30条通路绘制成气泡图。 1.7 潜在活性成分-靶蛋白分子对接
为了进一步验证靶点预测结果的可靠性及了解活性成分与靶蛋白的结合方式，对PPI网络中连接度值排名较高的靶点与药物-化合物-靶点-疾病网络中的重要化合物进行分子对接验证。通过PubChem获得化合物3D结构的SDF文件，通过Open Babel 2.3.0软件将其转换为MOL2文件格式。通过SailVina 2.0软件将对化合物批量进行加氢、加电荷、能量最小化等处理，并保存为PDBQT格式文件。通过PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）找到相应靶点的PDB ID，并下载PDB文件，运用PyMOL 2.5软件对靶蛋白中的进行去水、提取化合物等处理，通过插件获取对接盒子参数，保存为PDB后缀的文件。运用AutoDockTools软件给靶蛋白加氢、加电荷，转成PDBQT文件。使用AutoDock Vina对化合物和靶蛋白进行对接。结合能小于0说明可以自发结合，结合能的负绝对值越大，说明配体与受体的对接亲合力越大，同时也说明小分子与受体结合的活性越高。把对接结果较好的靶蛋白和化合物通过PyMOL进行结合方式展现。
2 结果
2.1 四逆散和IBS的相关靶点
综合TCMSP数据库、文献研究及《中华人民共和国药典》[8]检索结果，从四逆散中检索到130个药效化合物，其中，柴胡13个，白芍8个，枳实17个，甘草92个。合并4个药物数据，并去除重复的成分及靶点，得到四逆散123种化学成分，245个靶蛋白。通过DisGeNET平台获得靶点基因167个，通过OMIM平台获得靶点基因34个，通过GeneCards平台获得靶点基因2 791个，relevance score≥30的基因有140个，将3个平台汇总并去除重复项，最终获得IBS相关基因302个。
2.2 四逆散治疗IBS的潜在关键作用靶点
使用Omicshare平台将药物的潜在作用靶点和疾病的相关靶点进行匹配并绘制韦恩图，获得交集基因47个。其中，柴胡的潜在关键作用靶点39个，白芍16个，枳实21个，甘草41个。见图1、表1。
2.3 四逆散治疗IBS关键靶点的PPI网络分析
将四逆散治疗IBS的47个关键靶点导入STRING数据库中获取PPI关系，并得到PPI网络图。该网络图共47个节点，466条边。其中，度值排名前5的靶点基因为IL-6、AKT1、TP53、TNF、FOS。见图2。
2.4 药物-化合物-靶点-疾病网络的构建和分析
在构建网络图前，需将作用于靶点的药物成分信息进行筛选提取，通过Perl脚本的运行构建彼此相应的关系，获得四逆散治疗IBS相关靶点对应的有效成分信息。然后将四逆散、89个作用于靶点的药物活性成分的分子编码、47个关键靶点信息、IBS导入Cytoscape，进行网络构建及可视化。其中，槲皮素、山柰酚、川陈皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、芒柄花素、甘油三酯、刺果甘草查耳酮、1-甲氧基菜豆素、3’-甲氧基光甘草定、β-谷甾醇等43種成分可以和3个以上的关键靶点相连，连接度值排名前5的靶基因为AR、NOS2、PPARG、SCN5A、KCNH2，表明以上成分及基因是四逆散治疗IBS的重要成分和重要靶点。见表2、图3。
2.5 关键靶点的GO分析和KEGG通路分析
GO分析结果显示，关键靶点所富集的生物学过程以对化学信号的反应（36个靶点）、对氮化合物反应（19个靶点）、多细胞生物过程的调节（24个靶点）、对有机氮化合物的反应（19个靶点）、对含氧化合物的反应（27个靶点）为主。见图4。
KEGG通路主要富集的通路为细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、T细胞受体信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、类NOD受体信号通路等，并与炎症性肠病、非酒精性脂肪肝等消化系统疾病有关。见图5。
2.6 分子对接分析
皮素、芒柄花素4个成分和IL-6（PDB ID：1alu）、AKT1（PDB ID：3mv5）、TP53（PDB ID：6ggc）、TNF（PDB ID：2az5）4个靶蛋白进行分子对接。4种化合物与4个靶蛋白的结合能均小于-5 kcal/mol，说明活性成分化合物与筛选出来的靶点发生作用的可能性较大，验证了预测结果的可靠性。其中，槲皮素与各靶点的结合分数较佳，将其结合方式用PYMOL进行展示。见表3、图6。
3 讨论
四逆散为《伤寒论·辨少阴病脉证并治》名方，方中柴胡为君，疏肝解郁，升发阳气;白芍为臣，敛阴养血柔肝，助柴胡条达肝气;枳实为佐，理气解郁，泄热破结，与柴胡一升一降，调畅气机，与白芍相配，理气和血;甘草为使，调和诸药，健脾和中;四药合用，共奏疏肝健脾止泻之功。
通过药物-化合物-靶点-疾病网络发现，柴胡、甘草中所含的槲皮素，柴胡、白芍、甘草的共同成分山柰酚，枳实中的川陈皮素，甘草中的芒柄花素在网络中占有重要地位。文献[9]显示，槲皮素不仅可以激活Nrf2信号通路，加强机体的抗氧化应激水平相关，还可抑制NF-κB信号通路，降低促炎因子释放，此外，槲皮素还能通过抑制肠道蠕动，降低肠道毛细血管的通透性来发挥止泻作用。刘丽娜等[10]通过细胞实验发现，槲皮素可改善上皮细胞的通透性进而增强肠上皮屏障功能。研究[11]表明，山奈酚可显著抑制炎症因子的产生，提示其具有抗炎的作用。此外，山奈酚的抗炎机制还体现在调节促炎酶的活性和炎症相关基因表达，抑制转录因子、黏附分子以及基质金属蛋白酶等方面[12]。川陈皮素具有双向调节大鼠空肠平滑肌收缩性的作用，可显著降低结肠通透性，保护受损的肠黏膜屏障[13]。芒柄花素通过抑制外钙内流及内钙释放等离子通道相关机制，对家兔离体小肠的平滑肌收缩起到了明显的抑制作用，说明其可应用于治疗肠痉挛性疾病及肠道动力紊乱等疾病[14]。上述4种物质均属于黄酮类化合物，预测结果与报道基本一致，体现了四逆散治疗IBS多成分多靶点协同作用的方式。 PPI网络的结果显示，IL-6、AKT1、TP53、TNF 4个靶点在网络中占有重要地位，同时，经过分子对接结果验证，提示它们可作为四逆散治疗IBS的关键靶点。IL-6是人体内重要的炎性因子，作为炎性反应的调节介质，它促使疾病进展并维持免疫反应[15]。研究[16-17]发现，低度的炎症或免疫激活，可以触发或加重IBS，而IL-6可通过作用于肠道神经元和平滑肌细胞的方式引起感觉运动功能的改变，造成肠黏膜敏感性升高，这也解释了IBS患者外周血中IL-6含量明显升高的原因。TNF与IL-6同为促炎细胞因子，具有多种生物学活性，比如影响NF-κB通路，通过正反馈的方式使得炎症反应逐级放大[18]。研究[19]发现，IBS患者血清中的TNF-α水平明显高于正常人，且有焦虑或抑郁等伴随症状的患者TNF-α水平高于单纯的IBS患者。感染性胃肠炎的患者更容易发生IBS，这可能与感染后导致的炎症细胞趋化和免疫细胞的激活有关，该过程会释放多种炎性介质如TNF、IL等，进而破坏肠黏膜屏障，增加其通透性，诱导IBS的发生[20]。上述细胞因子在IBS发病过程中起到重要作用，四逆散的药效成分可能通过作用于这些疾病的靶蛋白来调节免疫系统进而发挥治疗IBS的作用。
KEGG通路富集分析得到与免疫和炎症相关的一类通路，以T细胞受体信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路为代表。Toll样受体信号通路作为经典的炎症通路，在机体应激条件下，该通路中受体异常激活，使下游κB等信号分子激活，导致炎性细胞和炎性因子失衡，进而造成IBS的发生和发展[21]。此外，Toll样受体、NF-κB信号通路的激活可导致慢性内脏痛觉高敏的形成[22]。这些通路均与IBS的发展有密切关系，且富集结果提示，四逆散的药效成分的关键靶点分布于不同的通路，T细胞受体信号通路可能通过调控TNF、AKT1等靶点，TNF信号通路、Toll样受体信号通路可能通过调控TNF、IL-6、AKT1等靶点起到四逆散治疗IBS的效果，以上通路及靶点主要通过减轻免疫介导的炎症反应的方式发挥治疗IBS的作用。这些通路及蛋白靶点可作为未来进一步探讨和研究的方向。
本文应用网络药理学及分子对接技术，从系统生物学的角度对四逆散治疗IBS多成分、多靶点、多通路的复杂网络关系和机制进行探讨。通过网络构建、通路富集，从分子网络水平系统研究了四逆散的主要活性成分及其关键作用靶点和相关通路，为深入研究四逆散治疗IBS的作用机制提供了思路。
参考文献
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（本文编辑 贺慧娥 黎志清）
〔关键词〕 肠易激综合征;信号通路;四逆散;网络药理学;靶点;分子对接
〔中图分类号〕R259 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.015
Molecular Mechanism of Sini Powder in the Treatment of Irritable Bowel Syndrome
Based on the Analysis of Key Targets and Related Signal Pathways
LI Jiarong1， DENG Haixia2， CHEN Gengxin2*
（1. The Second Clinical School， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405， China;
2. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510120， China）
〔Abstract〕 Objective To predict the molecular mechanism of Sini Powder in treating irritable bowel syndrome （IBS） based on network pharmacology and molecular docking method. Methods The traditional Chinese medicine system pharmacology （TCMSP） was employed to screen the active ingredients of Sini Powder. GeneCards， DisGeNET and OMIM databases were used to predict and screen the disease-related targets of IBS. The Omicshare platform was employed to match the putative targets of ingredients and disease-related targets to obtain key targets. Then， protien-protien interaction network was constructed by using STRING database and the “medicine-chemical compound-targets-disease” network was constructed by using Cytoscape software. GoEast database was used to perform GO analysis on key targets of Sini Powder in the treatment of IBS， and DAVID database was used to perform KEGG pathway analysis. The reliability of the results was further verified by molecular docking. Results Through screening， 123 drug active ingredients were screened， involving a total of 245 targets and 89 of them related to IBS， mainly through the regulation of target proteins such as IL-6 and TNF and toll-like receptor signaling pathway and NF-κB signaling pathway in the process of IBS inflammation. The results of molecular docking showed that the main components had good binding with the key targets. Conclusion Sini Powder may play a role in the treatment of IBS through the role of immune， inflammation system related protein targets and pathways. 〔Keywords〕 irritable bowel syndrome; signal pathway; Sini Powder; network pharmacology; target; molecular docking
肠易激综合征（irritable bowel syndrome， IBS）是一种常见的功能性消化疾病，以反复腹痛和排便习惯改变为特征，常伴有腹胀、抑郁等症状。根据罗马Ⅳ诊断标准，亚洲国家的IBS发病率为5%～10%，且女性患病率高于男性[1]。IBS发病机制尚不明确，现被广泛认可的假说有胃肠道动力障碍、免疫与炎症、内脏超敏反应、脑-肠轴功能紊乱、肠道菌群失调、遗传易感性等，当前西医治疗手段有限，以基于症状的心理干预、饮食控制和药物控制为主，但效果不显著且易复发，而中医辨证论治在IBS治疗上有较大优势[2-3]。
IBS可根据其症状纳入中医学“泄泻”“肠郁”“腹痛”“郁证”等范畴，多与先天不足或后天失养、情志不调、饮食失节有关[1]。四逆散是张仲景《伤寒论·辨少阴病脉证并治》中的名方，由柴胡、白芍、枳实、甘草四味中药组成，其中，柴胡和甘草补脾体、疏肝气;枳实和白芍宣畅气机、散阴结，以达疏肝解郁、健脾止泻之效。因其配伍得当，疗效甚佳，在临床上被广泛应用于治疗各种消化系统疾病[4]。有学者对四逆散治疗IBS的综合疗效进行系统评价，分析结果显示四逆散加减治疗IBS的临床疗效优于西医常规疗法[5]。动物实验[6]发现，四逆散可以改善动物状态和肠道功能，进而治疗肝脾不调型IBS模型大鼠;还可通过降低肠道敏感性、降低血清5-羟色胺含量、改善胃肠电生理活动等机制治疗内脏高敏感性IBS模型大鼠。但目前关于四逆散治疗IBS的相关研究多集中在临床研究和动物实验方面，分子水平的作用机制探讨较为稀缺。
单味中药或组方均具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，而网络药理学正是以系统生物学为基础，从整体的角度系统地阐述疾病与药物之间的关系以及药物与机体之间相互作用的规律的研究方法。此外，从整体出发，更有利于全面揭示中药及中药方剂的药理作用和分子机制。最后，通过分子对接了解化合物与靶点结合的方式及结合稳定性，进一步验证结果的可靠性[7]。本文应用网络药理学及分子对接的方法，对四逆散治疗IBS的成分及靶点进行整理和分析，为了解其作用机制提供更全面的认知和更系统的帮助。
1 方法
1.1 药物药效成分及潜在作用靶点的收集
使用TCMSP平台（https：//www.tcmsp-e.com/）收集柴胡、白芍、枳实、甘草4味中药的化学成分，筛选口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18的化学成分作为四逆散中具有良好OB和DL的药效成分，同时结合文献研究及《中华人民共和国药典》[8]对四逆散所含药物中有明显药效成分的化合物进行补充，并分别找出这些成分对应的作用靶点、将得到的作用靶点通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）以物种为“Homo sapiens”进行筛选，获得与药效成分化合物相关的潜在作用靶点的蛋白信息。若化合物及其靶点未被收录在TCMSP中，则通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得SMILE格式，并导入SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点获取。
1.2 疾病相关靶点的收集
以“irritable bowel syndrome”为关键词，从DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）中查找IBS相关基因，其中，选取GeneCards数据库所得结果中relevance score≥30（relevance score是该数据库中用于评估基因与疾病相关性的指标，分數越大代表相关性越高）的基因纳入此次分析，同时将这批基因与DisGeNET、OMIM数据库所得结果进行合并，删除重复和假阳性的基因，得到与IBS的相关靶点。
1.3 潜在关键作用靶点的获取
通过Omicshare平台（https：//www.omicshare.com/），将四逆散药效成分的潜在作用靶点和IBS的相关靶点进行匹配映射，并绘制韦恩图获得四逆散治疗IBS的关键作用靶点。
1.4 蛋白-蛋白相互作用（protein protein interaction， PPI）网络的构建
把“1.3”中得到的关键作用靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/），研究物种设定为人，获得蛋白相互作用关系，将结果以PNG格式和TSV格式导出，并将结果导入Cytoscape 3.6.2（http：//www.cytoscape.org）软件制作PPI网络图。
1.5 药物-化合物-靶点-疾病网络的构建
使用Cytoscape构建“药物-活性成分-关键靶点-疾病”，网络中节点代表四逆散、药物活性成分的分子编码、关键靶点、疾病;网络中的边用来连接方剂中的药物与活性成分分子编码、活性成分分子编码与关键靶点、关键靶点与疾病。该网络将药物-化合物-靶点-疾病之间的关系可视化，并通过它剖析四逆散治疗IBS的作用机制。
1.6 关键靶点的通路注释和可视化分析
将关键靶点通过GoEast（http：//omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/）进行GO富集分析;应用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）进行KEGG通路富集分析。GO分析结果包括生物学过程（biological process， BP）的内容，取BP P值最小的10条条目制作气泡图。将KEGG富集分析结果取P值最小的30条通路绘制成气泡图。 1.7 潜在活性成分-靶蛋白分子对接
为了进一步验证靶点预测结果的可靠性及了解活性成分与靶蛋白的结合方式，对PPI网络中连接度值排名较高的靶点与药物-化合物-靶点-疾病网络中的重要化合物进行分子对接验证。通过PubChem获得化合物3D结构的SDF文件，通过Open Babel 2.3.0软件将其转换为MOL2文件格式。通过SailVina 2.0软件将对化合物批量进行加氢、加电荷、能量最小化等处理，并保存为PDBQT格式文件。通过PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）找到相应靶点的PDB ID，并下载PDB文件，运用PyMOL 2.5软件对靶蛋白中的进行去水、提取化合物等处理，通过插件获取对接盒子参数，保存为PDB后缀的文件。运用AutoDockTools软件给靶蛋白加氢、加电荷，转成PDBQT文件。使用AutoDock Vina对化合物和靶蛋白进行对接。结合能小于0说明可以自发结合，结合能的负绝对值越大，说明配体与受体的对接亲合力越大，同时也说明小分子与受体结合的活性越高。把对接结果较好的靶蛋白和化合物通过PyMOL进行结合方式展现。
2 结果
2.1 四逆散和IBS的相关靶点
综合TCMSP数据库、文献研究及《中华人民共和国药典》[8]检索结果，从四逆散中检索到130个药效化合物，其中，柴胡13个，白芍8个，枳实17个，甘草92个。合并4个药物数据，并去除重复的成分及靶点，得到四逆散123种化学成分，245个靶蛋白。通过DisGeNET平台获得靶点基因167个，通过OMIM平台获得靶点基因34个，通过GeneCards平台获得靶点基因2 791个，relevance score≥30的基因有140个，将3个平台汇总并去除重复项，最终获得IBS相关基因302个。
2.2 四逆散治疗IBS的潜在关键作用靶点
使用Omicshare平台将药物的潜在作用靶点和疾病的相关靶点进行匹配并绘制韦恩图，获得交集基因47个。其中，柴胡的潜在关键作用靶点39个，白芍16个，枳实21个，甘草41个。见图1、表1。
2.3 四逆散治疗IBS关键靶点的PPI网络分析
将四逆散治疗IBS的47个关键靶点导入STRING数据库中获取PPI关系，并得到PPI网络图。该网络图共47个节点，466条边。其中，度值排名前5的靶点基因为IL-6、AKT1、TP53、TNF、FOS。见图2。
2.4 药物-化合物-靶点-疾病网络的构建和分析
在构建网络图前，需将作用于靶点的药物成分信息进行筛选提取，通过Perl脚本的运行构建彼此相应的关系，获得四逆散治疗IBS相关靶点对应的有效成分信息。然后将四逆散、89个作用于靶点的药物活性成分的分子编码、47个关键靶点信息、IBS导入Cytoscape，进行网络构建及可视化。其中，槲皮素、山柰酚、川陈皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、芒柄花素、甘油三酯、刺果甘草查耳酮、1-甲氧基菜豆素、3’-甲氧基光甘草定、β-谷甾醇等43種成分可以和3个以上的关键靶点相连，连接度值排名前5的靶基因为AR、NOS2、PPARG、SCN5A、KCNH2，表明以上成分及基因是四逆散治疗IBS的重要成分和重要靶点。见表2、图3。
2.5 关键靶点的GO分析和KEGG通路分析
GO分析结果显示，关键靶点所富集的生物学过程以对化学信号的反应（36个靶点）、对氮化合物反应（19个靶点）、多细胞生物过程的调节（24个靶点）、对有机氮化合物的反应（19个靶点）、对含氧化合物的反应（27个靶点）为主。见图4。
KEGG通路主要富集的通路为细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、T细胞受体信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、类NOD受体信号通路等，并与炎症性肠病、非酒精性脂肪肝等消化系统疾病有关。见图5。
2.6 分子对接分析
皮素、芒柄花素4个成分和IL-6（PDB ID：1alu）、AKT1（PDB ID：3mv5）、TP53（PDB ID：6ggc）、TNF（PDB ID：2az5）4个靶蛋白进行分子对接。4种化合物与4个靶蛋白的结合能均小于-5 kcal/mol，说明活性成分化合物与筛选出来的靶点发生作用的可能性较大，验证了预测结果的可靠性。其中，槲皮素与各靶点的结合分数较佳，将其结合方式用PYMOL进行展示。见表3、图6。
3 讨论
四逆散为《伤寒论·辨少阴病脉证并治》名方，方中柴胡为君，疏肝解郁，升发阳气;白芍为臣，敛阴养血柔肝，助柴胡条达肝气;枳实为佐，理气解郁，泄热破结，与柴胡一升一降，调畅气机，与白芍相配，理气和血;甘草为使，调和诸药，健脾和中;四药合用，共奏疏肝健脾止泻之功。
通过药物-化合物-靶点-疾病网络发现，柴胡、甘草中所含的槲皮素，柴胡、白芍、甘草的共同成分山柰酚，枳实中的川陈皮素，甘草中的芒柄花素在网络中占有重要地位。文献[9]显示，槲皮素不仅可以激活Nrf2信号通路，加强机体的抗氧化应激水平相关，还可抑制NF-κB信号通路，降低促炎因子释放，此外，槲皮素还能通过抑制肠道蠕动，降低肠道毛细血管的通透性来发挥止泻作用。刘丽娜等[10]通过细胞实验发现，槲皮素可改善上皮细胞的通透性进而增强肠上皮屏障功能。研究[11]表明，山奈酚可显著抑制炎症因子的产生，提示其具有抗炎的作用。此外，山奈酚的抗炎机制还体现在调节促炎酶的活性和炎症相关基因表达，抑制转录因子、黏附分子以及基质金属蛋白酶等方面[12]。川陈皮素具有双向调节大鼠空肠平滑肌收缩性的作用，可显著降低结肠通透性，保护受损的肠黏膜屏障[13]。芒柄花素通过抑制外钙内流及内钙释放等离子通道相关机制，对家兔离体小肠的平滑肌收缩起到了明显的抑制作用，说明其可应用于治疗肠痉挛性疾病及肠道动力紊乱等疾病[14]。上述4种物质均属于黄酮类化合物，预测结果与报道基本一致，体现了四逆散治疗IBS多成分多靶点协同作用的方式。 PPI网络的结果显示，IL-6、AKT1、TP53、TNF 4个靶点在网络中占有重要地位，同时，经过分子对接结果验证，提示它们可作为四逆散治疗IBS的关键靶点。IL-6是人体内重要的炎性因子，作为炎性反应的调节介质，它促使疾病进展并维持免疫反应[15]。研究[16-17]发现，低度的炎症或免疫激活，可以触发或加重IBS，而IL-6可通过作用于肠道神经元和平滑肌细胞的方式引起感觉运动功能的改变，造成肠黏膜敏感性升高，这也解释了IBS患者外周血中IL-6含量明显升高的原因。TNF与IL-6同为促炎细胞因子，具有多种生物学活性，比如影响NF-κB通路，通过正反馈的方式使得炎症反应逐级放大[18]。研究[19]发现，IBS患者血清中的TNF-α水平明显高于正常人，且有焦虑或抑郁等伴随症状的患者TNF-α水平高于单纯的IBS患者。感染性胃肠炎的患者更容易发生IBS，这可能与感染后导致的炎症细胞趋化和免疫细胞的激活有关，该过程会释放多种炎性介质如TNF、IL等，进而破坏肠黏膜屏障，增加其通透性，诱导IBS的发生[20]。上述细胞因子在IBS发病过程中起到重要作用，四逆散的药效成分可能通过作用于这些疾病的靶蛋白来调节免疫系统进而发挥治疗IBS的作用。
KEGG通路富集分析得到与免疫和炎症相关的一类通路，以T细胞受体信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路为代表。Toll样受体信号通路作为经典的炎症通路，在机体应激条件下，该通路中受体异常激活，使下游κB等信号分子激活，导致炎性细胞和炎性因子失衡，进而造成IBS的发生和发展[21]。此外，Toll样受体、NF-κB信号通路的激活可导致慢性内脏痛觉高敏的形成[22]。这些通路均与IBS的发展有密切关系，且富集结果提示，四逆散的药效成分的关键靶点分布于不同的通路，T细胞受体信号通路可能通过调控TNF、AKT1等靶点，TNF信号通路、Toll样受体信号通路可能通过调控TNF、IL-6、AKT1等靶点起到四逆散治疗IBS的效果，以上通路及靶点主要通过减轻免疫介导的炎症反应的方式发挥治疗IBS的作用。这些通路及蛋白靶点可作为未来进一步探讨和研究的方向。
本文应用网络药理学及分子对接技术，从系统生物学的角度对四逆散治疗IBS多成分、多靶点、多通路的复杂网络关系和机制进行探讨。通过网络构建、通路富集，从分子网络水平系统研究了四逆散的主要活性成分及其关键作用靶点和相关通路，为深入研究四逆散治疗IBS的作用机制提供了思路。
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（本文编辑 贺慧娥 黎志清）