【摘 要】
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琥珀酸(succinic acid)是一种四碳二羧酸,在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用.目前,微生物法生产琥珀酸存在得率低、生产强度低、副产物积累等问题.为此,本研究通过复合诱变(ARTP和60Co-γ射线)筛选到一株耐高渗突变株FMME-N-2,其琥珀酸得率为0.70g/g葡萄糖,同时积累18.8g/L乳酸、7.6g/L甲酸和17.3g/L乙酸.为了提高琥珀酸得率,通过敲除乳酸脱氢酶基因(ldhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶-甲酸转运蛋白基因(pflB-focA)、磷酸转乙酰基基因(pta)、丙酸激
【机 构】
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江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;江南大学国际食品安全联合实验室,江苏无锡214122
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琥珀酸(succinic acid)是一种四碳二羧酸,在食品、医药、塑料和化工行业具有广泛的应用.目前,微生物法生产琥珀酸存在得率低、生产强度低、副产物积累等问题.为此,本研究通过复合诱变(ARTP和60Co-γ射线)筛选到一株耐高渗突变株FMME-N-2,其琥珀酸得率为0.70g/g葡萄糖,同时积累18.8g/L乳酸、7.6g/L甲酸和17.3g/L乙酸.为了提高琥珀酸得率,通过敲除乳酸脱氢酶基因(ldhA)、丙酮酸-甲酸裂解酶-甲酸转运蛋白基因(pflB-focA)、磷酸转乙酰基基因(pta)、丙酸激酶基因(tdcD)和a-酮丁酸甲酸酯裂解酶基因(tdcE),阻断冗余代谢支路减少副产物积累,获得工程菌株FMME-N-13,琥珀酸得率增加到0.92g/g葡萄糖,同时副产物大大降低,积累0.6g/L乳酸、3.6g/L甲酸和12.3g/L乙酸.同时,通过调控RBS强度组合优化来自产琥珀酸放线杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(AsPCK)和来自博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶基因(CbFDH)的表达水平,调控胞内ATP和NADH的浓度,最优工程菌FMME-N-26(FMME-N-13-L-AsPCK-L-CbFDH)的琥珀酸得率增加至1.04g/g葡萄糖,仅积累5.5g/L乙酸;最终,对厌氧阶段葡萄糖浓度进行优化,当葡萄糖浓度控制在0～5g/L时,菌株FMME-N-26的琥珀酸浓度增加到111.9g/L,得率为1.11g/g葡萄糖(理论产率的99％),生产强度为1.76g/L/h,为琥珀酸的工业化生产奠定了良好的基础.
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