探讨不同胚龄SD大鼠胎鼠颌突外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells, EMSC)的体外矿化能力,以及p75神经营养受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)在矿化过程中的表达变化,揭示p75NTR在牙齿硬组织矿化中的调控作用与机制。
方法分离培养孕12.5 d(E12.5 d)、E15.5 d和E18.5 d的SD大鼠胎鼠颌突EMSC,通过流式检测技术对比各组细胞群的细胞表型;分别对E12.5 d、E15.5 d和E18.5 d的EMSC进行体外矿化诱导,7 d后进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测,21 d后茜素红染色观察矿化结节形成情况,同时采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测0、7、14和21 d的Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2)、Ⅰ型胶原、ALP和p75NTR的表达情况。
结果细胞表面特异性标志物CD29、CD146和p75NTR在E12.5 d、E15.5 d和E18.5 d的EMSC中均呈阳性表达,CD45为阴性表达,其中p75NTR在E18.5 d的EMSC中阳性表达率为84.04%,高于E12.5 d(22.53%)和E15.5 d(81.43%);诱导21 d后茜素红染色显示,E18.5 d的EMSC实验组矿化能力较强,ALP活性变化趋势与茜素红染色结果一致;蛋白质印迹法结果显示:RUNX2、Ⅰ型胶原表达量在E18.5d的EMSC实验组(RUNX2: 1.92±0.20,Ⅰ型胶原:1.85±0.66)显著高于E12.5 d(RUNX2: 0.38±0.02,Ⅰ型胶原:0.33±0.94)和E15.5 d组(RUNX2: 0.72±0.22,Ⅰ型胶原:0.64±0.07)(P< 0.05),p75NTR的表达在诱导21 d的实验组(E12.5 d: 0.79±0.23、E15.5 d: 0.84±0.29、E18.5 d: 1.35±0.22)均显著高于相同时间点对照组(E12.5 d: 0.42±0.12、E15.5 d: 0.43±0.13、E18.5 d: 0.48±0.15)(P<0.05),其余各组间差异无统计学意义;实时定量PCR结果进一步印证了蛋白质印迹法结果。
结论p75NTR参与EMSC的矿化过程,E18.5 d的EMSC矿化能力最强,p75NTR表达量最高,是牙组织工程较理想的种子细胞。