【摘 要】
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目的构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体，通过气管内注射慢病毒载体，局部部分沉默小鼠肺部TMEM16A基因的表达，为后续在体研究TMEM16A在肺部作用提供基础。方法①构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体；②免疫荧光法验证LA795小鼠肺腺癌细胞膜上TMEM16A的表达，体外行慢病毒感染实验，确定感染的最佳条件，最后体外实验确定慢病毒的干扰效率；③链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接法
【机 构】
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目的构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体，通过气管内注射慢病毒载体，局部部分沉默小鼠肺部TMEM16A基因的表达，为后续在体研究TMEM16A在肺部作用提供基础。
方法①构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体；②免疫荧光法验证LA795小鼠肺腺癌细胞膜上TMEM16A的表达，体外行慢病毒感染实验，确定感染的最佳条件，最后体外实验确定慢病毒的干扰效率；③链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接法(streptavidin-perosidase，SP)法验证肺组织中TMEM16A的表达；④气管内注射慢病毒2周后行支气管肺泡灌洗，BAC法检测灌洗液中蛋白及酶联免疫吸附法测定(ELISA)法检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-a，TNF-α)、IL-1β及IL-10的浓度；⑤气管内注射慢病毒2周后取材肺组织提取蛋白用蛋白印迹法(Western blot)验证在体TMEM16A-shRNA慢病毒载体的沉默效率。
结果①LA795细胞膜上存在TMEM16A的表达，LA795细胞在5 mg/L的Eni.S+polybrene条件下容易被感染，病毒感染复数(MOI)为20；②Western blot进一步显示体外细胞慢病毒shRNA的沉降效率约81.35%(P<0.05)；③气管内注入Lenti-Neg-shRNA后BALF的蛋白含量无增加，细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-10的浓度无明显变化(P>0.05)；光镜下肺组织结构正常，未造成病理损伤；④气管内注入Lenti-TMEM16A-shRNA后，Western-blot结果显示TMEM16A表达水平降低(P<0.05)，达到在肺部部分沉默TMEM16A的目的。
结论本研究成功构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体，体内实验证实慢病毒气管内注射是比较安全，未增加肺组织的蛋白渗漏及病理损伤，并能有效转染气道及肺泡上皮细胞并在局部表达，成功沉默肺部TMEM16A的表达。
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