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[摘要] 目的 通过观察雷公藤内酯醇（TP）对高糖刺激下ILK、MMP9、NEPH1蛋白表达的影响，探讨TP抑制足细胞上皮-间充质转分化（EMT）治疗糖尿病肾病的可能机制。 方法 将培养分化成熟的足细胞分为对照组（D-葡萄糖5 mmol/L）、高糖组（D-葡萄糖25 mmol/L）、低TP组（25 mmol/L D-葡萄糖 8 ng/mL TP）、中TP组（25 mmol/L D-葡萄糖 16 ng/mL TP）以及高TP组（25 mmol/L D-葡萄糖 32 ng/mL TP）。体外培养48 h后，倒置显微镜观察细胞形态，并采用PCR半定量分析技术检测ILK、MMP9、NEPH1的表达。 结果 高糖刺激下足细胞NEPH1的表达较对照组显著减少（P<0.01），而ILK、MMP9的mRNA表达较对照组显著升高（P<0.01）。各剂量TP组足细胞NEPH1 mRNA的表达均较高糖组明显上调（P<0.01），ILK、MMP9 mRNA的表达较高糖组明显下降（P<0.01），其中以中TP组的干预作用最显著（P<0.01）。 结论 TP可能通过抑制ILK信号通路来抑制足细胞EMT。
[关键词] 雷公藤内酯醇；足细胞；高糖；上皮-间充质转分化
[中图分类号] R197 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）31-0001-04
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一类以进行性肾脏纤维化为特征的疾病，是糖尿病最主要的微血管并发症之一。其最主要的临床表现为蛋白尿，而肾小球纤维化是产生蛋白尿的组织学基础。足细胞通过已分化上皮细胞向间充质细胞转分化（Mesenchymal transdifferentiation，EMT），是影响肾小球滤过屏障功能和结构，使肾小球纤维化的重要因素[1]。其特点为失去上皮细胞特征如足细胞裂孔膜蛋白（nephrin）和NEPH1～3等，导致成纤维细胞特殊蛋白l（fibroblast-specific protein 1，FSP-1）、整合素连接激酶（ILK）、细胞外基质纤维连接蛋白（fibronectin，FN）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）等间充质细胞样表型标志物表达上调[2]。已发现的介导足细胞EMT的主要信号通路有TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-acatenin三条。三条通路既有各自的信号传导路径，又在不同层面相互连接、整合，组成错综复杂的网络，共同调控足细胞的EMT过程。其中，ILK信号通路在足细胞EMT的过程中起重要的调节作用[3]。
雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.F.，TwHF）是藤本植物雷公藤的干燥块根，中药学认为其味苦、辛，性寒，有大毒，归肝、肾经。功能祛风除湿 、通络止痛，兼杀虫解毒。临床主要用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾脏疾病等炎性和自身免疫性疾病。其用于治疗肾病已有30余年历史 ，从最初的生药煎剂到雷公藤提取物，取得了令人瞩目的疗效[4]。雷公藤内酯醇（triptolide，TP）是从其中分离所得的一种二萜类化合物，可通过靶向转录因子、激酶或抑制泛素/蛋白酶体等机制发挥抑制细胞增殖和促肿瘤细胞凋亡等抗肿瘤作用[5]。大量体内外研究均证实，雷公藤内酯醇具有保护足细胞、抑制蛋白尿的作用[6，7]。本研究观察TP通过对ILK信号通路的调节作用，干预高糖诱导小鼠足细胞EMT，探讨TP对高糖环境下受损足细胞的可能保护机制。
1 材料与方法
1.1 一般材料
1.1.1 细胞 本研究采用的小鼠肾小球足细胞为英国伦敦大学国王学院Guy’s 医院赠送。
1.1.2 药物 葡萄糖（中国大冢制药有限公司），雷公藤内酯醇（杭州达文生物技术有限公司）。
1.2 仪器与试剂
超净工作台，空气过滤器（北京市昌平长城空气净化设备公司），恒温 CO2培养箱（B5060EK/CO2德国产），450 型自动酶标仪（MuLtiskan Ascent V1. 24345-00627T），伯樂PCR 仪，凝胶成像系统（ BIO-RAD），RPMI 1640培养液、胎牛血清（美国GIBCO公司），γ-干扰素（美国PEPROTECH公司），Trizol提取试剂盒（美国Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），引物合成（PRIMER5.0引物软件设计，上海生物工程公司合成），SDS-PAGE凝胶试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养 复苏后的小鼠足细胞加入含有5 mL 10% FCS1640培养液的50 mL培养瓶中，每瓶加入500 U γ-干扰素。置33℃、5%CO2培养箱孵育，细胞增殖传代后，转移入37℃、5%CO2培养箱（含有5 mL 10
[关键词] 雷公藤内酯醇；足细胞；高糖；上皮-间充质转分化
[中图分类号] R197 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）31-0001-04
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一类以进行性肾脏纤维化为特征的疾病，是糖尿病最主要的微血管并发症之一。其最主要的临床表现为蛋白尿，而肾小球纤维化是产生蛋白尿的组织学基础。足细胞通过已分化上皮细胞向间充质细胞转分化（Mesenchymal transdifferentiation，EMT），是影响肾小球滤过屏障功能和结构，使肾小球纤维化的重要因素[1]。其特点为失去上皮细胞特征如足细胞裂孔膜蛋白（nephrin）和NEPH1～3等，导致成纤维细胞特殊蛋白l（fibroblast-specific protein 1，FSP-1）、整合素连接激酶（ILK）、细胞外基质纤维连接蛋白（fibronectin，FN）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）等间充质细胞样表型标志物表达上调[2]。已发现的介导足细胞EMT的主要信号通路有TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-acatenin三条。三条通路既有各自的信号传导路径，又在不同层面相互连接、整合，组成错综复杂的网络，共同调控足细胞的EMT过程。其中，ILK信号通路在足细胞EMT的过程中起重要的调节作用[3]。
雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.F.，TwHF）是藤本植物雷公藤的干燥块根，中药学认为其味苦、辛，性寒，有大毒，归肝、肾经。功能祛风除湿 、通络止痛，兼杀虫解毒。临床主要用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾脏疾病等炎性和自身免疫性疾病。其用于治疗肾病已有30余年历史 ，从最初的生药煎剂到雷公藤提取物，取得了令人瞩目的疗效[4]。雷公藤内酯醇（triptolide，TP）是从其中分离所得的一种二萜类化合物，可通过靶向转录因子、激酶或抑制泛素/蛋白酶体等机制发挥抑制细胞增殖和促肿瘤细胞凋亡等抗肿瘤作用[5]。大量体内外研究均证实，雷公藤内酯醇具有保护足细胞、抑制蛋白尿的作用[6，7]。本研究观察TP通过对ILK信号通路的调节作用，干预高糖诱导小鼠足细胞EMT，探讨TP对高糖环境下受损足细胞的可能保护机制。
1 材料与方法
1.1 一般材料
1.1.1 细胞 本研究采用的小鼠肾小球足细胞为英国伦敦大学国王学院Guy’s 医院赠送。
1.1.2 药物 葡萄糖（中国大冢制药有限公司），雷公藤内酯醇（杭州达文生物技术有限公司）。
1.2 仪器与试剂
超净工作台，空气过滤器（北京市昌平长城空气净化设备公司），恒温 CO2培养箱（B5060EK/CO2德国产），450 型自动酶标仪（MuLtiskan Ascent V1. 24345-00627T），伯樂PCR 仪，凝胶成像系统（ BIO-RAD），RPMI 1640培养液、胎牛血清（美国GIBCO公司），γ-干扰素（美国PEPROTECH公司），Trizol提取试剂盒（美国Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），引物合成（PRIMER5.0引物软件设计，上海生物工程公司合成），SDS-PAGE凝胶试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养 复苏后的小鼠足细胞加入含有5 mL 10% FCS1640培养液的50 mL培养瓶中，每瓶加入500 U γ-干扰素。置33℃、5%CO2培养箱孵育，细胞增殖传代后，转移入37℃、5%CO2培养箱（含有5 mL 10