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摘要 许多革兰氏阴性病原细菌借助细菌的Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion system，T3SS）传递与致病有关的毒性因子和效应子来发挥病原细菌的毒性。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是海水中3种常见革兰氏阴性病原细菌。这3种细菌不仅广泛引起海水养殖生物的病害，还经常导致人类肠胃炎等其他危害，而Ⅲ型分泌系统也与它们的致病性密切相关。对海水中这3种常见革兰氏阴性病原菌Ⅲ型分泌系统的组成、功能及相关转录调控机制进行了综述。
关键词 革兰氏阴性病原菌；Ⅲ型分泌系统；毒力因子
中图分类号 S917.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）13-156-06
Abstract Many Gramnegative pathogenic bacteria develop their virulence factors or effectors to eukaryotic host cells through their type Ⅲ secretion systems（T3SSs）. Vibrio parahaemolyticus， Edwardsiella tarda and Aeromonas hydrophila are three common Gramnegative pathogens in marine aquaculture， which not only infect aquaculture animals but also cause gastroenteritis in humans. T3SS are suggested to be closely related to bacteria pathogenicity in these three pathogens. The recent progresses in the composition， function and regulation mechanism study of the T3SSs in those three pathogens were summarized.
Key words Gramnegative pathogens； Type Ⅲ secretion system； Virulence factors
海水養殖环境中存在多种具有条件致病性的革兰氏阴性菌，比如副溶血弧菌。副溶血弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，不仅能引起人类食物中毒性肠胃炎，还可引起水生动物（如海鲷、对虾、九孔鲍、文蛤等[1]）疾病。嗜水气单胞菌属于弧菌科气单胞菌属，在自然界广泛分布，可以感染多种水生及陆生动物，是一种重要的人、兽、鱼共患病病原菌[2]。迟缓爱德华氏菌是一种革兰氏阴性肠道病原菌，感染宿主范围广，在水产养殖生物中该菌是鱼类鳗、鲇和鲆等的重要致病菌[3]。目前，对病原菌的致病机理研究较多，溶血素、粘附因子和胞外蛋白等多种胞外物质被认为与病原菌的毒力有关，然而这些毒力因子不足以引起严重的致病症状，可能存在其他毒力较强的致病因子[4-6]。关于细菌毒力因子的鉴定和特征分析已取得许多进展，尽管如此不同毒力因子之间的联系以及进入宿主细胞的顺序仍然未确定[7]。
细菌分泌系统的发现是近年来细菌致病机制研究的重要进展。系统发育和遗传进化分析表明，细菌是通过几种分泌机制将蛋白性质的毒力因子分泌出去的。到目前为止，共发现7种类型的分泌系统，它们以各自特有的方式参与细菌的致病过程[8]。其中，Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion system，T3SS）与动植物革兰阴性病原菌的毒力因子分泌有关，因此备受关注。Ⅲ型分泌系统首次发现于小肠结肠炎耶尔森菌中，由George P.C.Salmond和Philip J.Reeves [9]于1993年首次命名，该系统广泛存在于革兰氏阴性菌（如志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、弧菌、假单胞菌和植物病原菌欧文氏菌属、黄单胞菌属等）中。海水环境中的某些革兰阴性病原菌中也发现具有T3SS系统，KwonSam Park等[10]证实副溶血弧菌T3SS具有对真核细胞的细胞毒性和肠毒性；Tan等[11]发现将迟缓爱德华氏菌T3SS相关基因突变后，突变株在鱼类巨噬细胞中的存活、复制和杀死鱼类细胞的能力都减弱；G.A.CarvalhoCastro等[12]利用PCR 技术检测从病鱼中分离的嗜水气单胞菌的T3SS，结果表明完整T3SS的存在增加了嗜水气单胞菌的毒性。多位生物学家通过试验证实副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的Ⅲ型分泌系统对真核细胞有较强的细胞毒性[13-16]，Ⅲ型分泌系统的存在与否直接影响病原菌的毒性强弱[15，17-18]。
笔者以副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌3种水产养殖环境中常见的革兰阴性病原菌为研究对象，对其Ⅲ型分泌系统的组成、相关结构蛋白、效应蛋白的功能以及相关表达调控过程的研究进展进行了综述。
1 Ⅲ型分泌系统
Ⅲ型分泌系统存在于革兰氏阴性菌中，广泛参与革兰氏阴性菌毒力因子的分泌，编码T3SS的基因通常成簇地以毒力岛（Pathogenicity island，PI）的形式存在于细菌的染色体或质粒上。与基因组其他部分相比，该分泌系统基因的GC含量较低或较高，目前认为是可转移的外源基因插入成分，通过水平传递而获得[19]。
所有已知动植物致病菌的Ⅲ型分泌系统都有许多高度保守的主要结构成分。Ⅲ型分泌系统由20种以上的蛋白质组成，是所有已知的蛋白质分泌系统中最复杂的[20]，其组分包括分泌蛋白、伴侣蛋白、结构蛋白和调节蛋白。调节蛋白对Ⅲ型分泌系统的基因表达起调节作用。分泌蛋白需要小的、通常是酸性、位于细胞质膜的附属蛋白，特异性地与之结合，这种附属蛋白质被称为伴侣蛋白[21]。分子伴侣能够稳定细胞质内相应的底物，阻止相应底物自身及其他效应蛋白或转位子蛋白未成熟前的同种或异种蛋白的结合，这种结合可能会导致结合蛋白的失活[22]。 Ⅲ型分泌系统的外排装置由几种完整的膜蛋白组成，横跨细胞内、外膜，并延伸形成一个针状结构通向胞外。各菌的Ⅲ型分泌系统在分泌功能上具有相似性，组织结构上却各有不同。虽然Ⅲ型分泌系统附属组件的结构和对称性是多元化的，但研究表明这些系统是由同源蛋白分子组装而成[23]。从图1可以看出，通用结构为多环基底结构嵌入内、外膜和细胞周质间隙中，基底端与胞内的外排装置和复杂ATP酶系统接触，末端针状的结构转运毒力蛋白，通过周质和胞外环境直接进入宿主细胞。Ⅲ型分泌系统分泌装置与鞭毛结构上有相似之处，可能由细菌鞭毛进化而来[24]。
Ⅲ型分泌系统受到接触诱导后分泌与毒力有关的多种蛋白质注入宿主细胞内，这些蛋白称为效应蛋白。Ⅲ型分泌系统可释放几种效应蛋白，刺激宿主细胞的信号转导途径，导致一系列的细胞效应[9]，如肌动蛋白的变构导致细胞骨架的重排、转录因子的激活、离子通道的刺激、在某些细胞会出现细胞凋亡等。这个分泌和转移过程是由非常复杂的转录和转录后的机制调控的。
2 副溶血弧菌的Ⅲ型分泌系统
2.1 副溶血弧菌T3SS的组成
2002年Tagomori [25]完成第1株副溶血弧菌全基因组测序，发现该菌含有2套Ⅲ型分泌系统（T3SS），分别为T3SS1和T3SS2，后者是关键的毒力系统，可以细分为T3SS2ɑ和T3SS2β。T3SS1位于染色体1上，有30个开放阅读框，序列与其他革兰氏阴性菌的T3SS相关基因有一定同源性。T3SS1存在于所有的副溶血弧菌分离株中，其GC含量与基因组其他区域有差别，被认为是该菌的遗传标记之一[26]。T3SS1的分泌装置由一系列结构蛋白组成，包括内膜蛋白VcrD1、外膜蛋白VscC1以及细胞周质蛋白VscN1[10]。 Ono T[13]等利用二维凝胶电泳对副溶血弧菌T3SS1突变株及其亲本株的分泌蛋白进行了对比分析，发现了T3SS1的4个分泌蛋白，分别为VP1656（VopD）、VP1680、VP1686和VPA450。Waddell B等[27]鉴定出VPA0451是VPA0450的特异性分子伴侣。VPA0451与已知的T3SS1分子伴侣结构相似，VPA0450转运进入宿主细胞需要VPA0451的协助。VPA0451直接结合于VPA0450，25～100位氨基酸是VPA0451的活性部位。因此，确定VPA0451是迄今为止发现的T3SS1的第2个分子伴侣。
T3SS2位于染色体2的毒力岛上[28]。副溶血弧菌KP+株拥有2种tdh基因，分别是tdhA和tdhS，不能同时拥有trh基因[29-31]；KP-株则拥有trh基因或者trh和tdh基因[10，32]。Okada N 等[33]对trh+副溶血弧菌TH3996株测序，发现在trh基因附近100 kb左右的DNA区域存在1种新的T3SS基因，经过动物试验及PCR分析发现这种T3SS基因存在于所有的被检测的trh+菌株中，并且对于细菌的胞外毒性必不可少，系统进化分析表明这种T3SS与KP+的T3SS2虽然有很近的关系，但却属于不同的系，这种新的T3SS2即T3SS2β。拟态弧菌和霍乱弧菌也存在T3SS2ɑ和T3SS2β基因，并且拟态弧菌与霍乱弧菌的关系更近。拟态弧菌和霍乱弧菌的T3SS2基因可能是通过水平基因转移得到的[34]。与T3SS1相似，副溶血弧菌vcrD2、vscC2和vscN2分别编码了T3SS2的内膜蛋白，外膜蛋白和细胞周质蛋白[10]。ZHOU等[28]用二维凝胶电泳方法对亲本株（敲除T3SS1结构基因vscN1的菌株）和突变株（敲除掉T3SS1和T3SS2的结构基因vscN1、vscN2的菌株）所分泌的蛋白进行对比分析，其中VopL、 VopT、VopA、VopV 和 VopC是已知的效应蛋白，VopB2、 VopD2 和VopW是T3SS2易位子的组成部分，是分泌装置的一部分，VopcC 是VopC的分子伴侣，另外还有VPA1336（VopZ）、 VPA1350、VPA1343；VPA1343 是T3SS2的分泌装置，VPA1350在转运过程中起结构或调节作用。Akeda Y等[35]研究发现VocC是T3SS2效应蛋白VopC和VopL的分子伴侣。
2.2 副溶血弧菌T3SS的作用
副溶血弧菌T3SS1主要贡献对宿主细胞的细胞毒性，介导宿主细胞的自体吞噬作用，最后导致细胞死亡。T3SS1的分泌蛋白中VopQ/A（VP1680）是T3SS1介導真核细胞毒性的最主要蛋白，具有对Hela细胞的细胞毒性。Sreelatha A等[36]研究表明即使环境中存在自噬的化学抑制剂，VopQ也足以引发宿主细胞的快速自噬，VopQ在溶酶体膜表面形成小孔，使溶酶体释放小于350 D的分子，从而诱导宿主细胞自噬。VopD也具有对Hela细胞的毒性，此外还具有溶血活性。VP1686不仅能通过抑制NFJB的活性来介导巨噬细胞死亡[37]，还能通过抑制RhoB的鸟苷三磷酸酶及下游的信号传导，阻止被感染细胞肌动蛋白的聚集和巨噬细胞肌动蛋白的快速重排，有助于抵抗巨噬细胞对病原菌的吞噬作用[38-40]。
副溶血弧菌T3SS2位于染色体2的毒力岛上，具有肠毒性。目前共鉴定出6种副溶血弧菌T3SS2的效应蛋白，VopA能活化激酶催化环结构中保守的赖氨酸乙酰化，阻止ATP的结合，最终阻止激酶的磷酸化[41]。VopT（VPA1327）具有核糖转移酶活性，部分贡献T3SS2对Caco2的细胞毒性[14]。VopL（VPA1370）能诱导肌动蛋白抗压纤维的形成，并加速肌动蛋白纤维丝的聚集[42]。VopC（VPA1321）与大肠杆菌细胞毒性坏死因子的同源性达38%[43]。Zhou等[28]首次阐明了VopZ在诱导腹泻中发挥独特作用，VopZ抑制丝裂原活化蛋白激酶MAP3K7（TAK1）的启动，控制MAPK和 NFκB信号传导途径，从而抑制细胞分裂。此外，N末端玻尿酸标记的VopZ能够在Hela细胞表面形成小孔。因此，VopZ对副溶血弧菌在肠道内的增殖作用不大，而有助于该菌在肠道内引起腹泻和组织破坏等疾病。 副溶血弧菌T3SS2效应蛋白分泌到宿主细胞中需要通过3种蛋白质形成的膜通道，分别为转运蛋白 VopB2、VopD2和VopW。Zhou X等[18]研究表明VopW帮助另外2种蛋白质插入宿主细胞膜形成膜通道，对效应蛋白分泌到宿主细胞必不可少。利用vopW基因的缺失菌株感染动物，发现菌株无法转运已知的T3SS2分泌蛋白到宿主细胞中，也无法检测到其他转运蛋白插入到宿主细胞膜中，而且在感染动物模型试验中缺失株是无毒的，这些结果结合VopW的大小和预测的二级结构，揭示VopW是副溶血弧菌的亲水性转运成分，引导VopD2 和VopB2 组装并插入到宿主细胞膜孔。另外，VopW自身可以转运到宿主细胞的细胞质，可能既是转运蛋白又是效应蛋白。
2.3 副溶血弧菌T3SS的主要调控因子及调控机制
副溶血弧菌ExsA与ExsD能够调控T3SS1基因簇的转录表达，ExsA为正向转录调控，ExsD为负向转录调控[44]。Zhou X等[45]通过不同抗原标记的重组蛋白共表达试验表明ExsC结合ExsD，并且ExsC的N末端对结合十分必要。抗原标记的ExsA和ExsD的共表达和纯化试验表明ExsD直接结合ExsA，猜测这种结合阻止了ExsA与T3SS1基因启动区的结合。总体而言，这些试验结果说明ExsD 结合ExsA阻止T3SS1的表达，ExsC结合ExsD 释放ExsA，从而允许T3SS1的表达，副溶血弧菌ExsA、ExsC和ExsD与铜绿假单胞菌调节因子在功能上有直系同源性。
3 嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统
3.1 嗜水气单胞菌T3SS的组成
Yu等[46]首次报道了嗜水气单胞菌AH1株中存在T3SS，利用基因步移法克隆了全长的T3SS序列，其中包括5个启动子和25个开放阅读框表达25种T3SS组分蛋白。AexT和AexU是嗜水气单胞菌的效应蛋白。AopN 蛋白是T3SS的重要组成部分，它是外在膜蛋白，ascV和aopB基因的编码产物是嗜水气单胞菌T3SS的必要构成成分，前者编码与T3SS固定在细菌内膜有关的蛋白，后者编码的蛋白是易位子的组装成分。Sha等[47]根据耶尔森菌T3SS基因yscV设计探针，在嗜水气单胞菌人源腹泻分离株SSU基因组文库中检测到全长26 855 bp的T3SS，共35个开放阅读框。通过对嗜水气单胞菌AH1株和SSU株的T3SS序列的比较发现，二者的同源性不高。基因序列的变化可能会改变蛋白质构象，从而产生不同的效应蛋白和结构蛋白，这也解释了虽然包括无毒株在内的许多嗜水气单胞菌都含有T3SS，但其结构不完全相同，也许决定了它們毒力方面的差异。
3.2 嗜水气单胞菌T3SS的作用
现已证实，嗜水气单胞菌存在2个效应蛋白（AexT[43，48]和AexU），杀鲑气单胞菌存在4个效应蛋白（AexT[49]、AopP[50]、AopH和AopO）。AexT是嗜水气单胞菌中发现的第1个效应蛋白，也是最小的效应蛋白。Vilches S等[45]对嗜温的嗜水气单胞菌AH3 株T3SS分泌的ADP核糖基化毒素（AexT）进行克隆和测序，发现AexT与杀鲑气单胞菌AexT的前半部分具有同源性。AexT具有ADP核糖转移酶活性，aexT基因缺失株的毒性与野生株相比轻微减小，而T3SS基因缺失株的毒性则大大降低。
Sierral等[15]证实嗜水气单胞菌SSU株AexU作为ADP核糖化转移酶和GTP酶活化蛋白，参与宿主细胞的凋亡和肌动蛋白的分解，AexU可以阻止cJun、JNK和JκB的磷酸化并抑制Hela细胞1L6和1L8的分泌，从而抑制NFκB和Rho GTP酶的活性。AexU与铜绿假单胞菌ExoT/S同源，氨基末端与耶尔森氏菌YopE活性相似，AexU 约有67%的序列与 AexT相似，然而其羧基端序列不与任何已知的蛋白质序列同源[44]。AexU羧基端的单核苷酸替换率约为17%，而AexT则要保守得多，其单核苷酸替换率在4%左右，或许AexU羧基端是独立于氨基端进化的，这不仅能产生不同的等位基因，而且产生多种 AexU效应蛋白以适应宿主体内不断变化的环境。此外，温和气单胞菌AexU共定位β4整合蛋白，产生应对宿主细胞的细胞毒素[51]。
ascV和aopB基因是嗜水气单胞菌T3SS的必要构成成分，前者编码与T3SS固定在细菌内膜有关的蛋白，后者编码的蛋白是易位子的组装成分。G.A.Carvalho Castro等[12]利用PCR技术从T3SS中检测ascV和aopB基因，估测2种基因在嗜水气单胞菌病原菌和环境分离株中的频率，2种基因有3种存在方式：ascV+/aopB+、ascV+/aopB-和ascV-/aopB-。检测到的64株病鱼分离菌ascV+/aopB+频率最高（62.5%），说明ascV+/aopB+病原菌能够引起鱼类极高的死亡率。环境分离株虽然有T3SS结构，但是毒力很低。PCR技术可以有效鉴定T3SS，并且可以将嗜水气单胞菌的毒力因子进行分类。谢振宣等[52]利用自杀性质粒成功构建了嗜水气单胞菌J1株ascV基因的缺失突变株，该突变株许多胞外产物缺失，毒力消失，说明AscV在嗜水气单胞菌J1株的致病过程中发挥重要作用。
3.3 嗜水气单胞菌T3SS的主要调控因子及调控机制
从图2可以看出，嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统的表达与其他毒力因子之间存在复杂的联系，如脂多糖、ahyIR群体感应系统、PhoPQ双组份系统和复杂的丙酮酸脱氢酶等。PhoPQ系统对胞外镁离子浓度敏感，低浓度镁离子激活PhoPQ的转录，高浓度则抑制其转录，PhoPQ抑制T3SS的表达。为了研究嗜水气单胞菌T3SS在体内的表达，Vilches S等[53]用绿色荧光蛋白标记和实时定量PCR方法分析aopNaopD和aexT基因启动区的活性，结果发现环境因子诱导嗜水气单胞菌AH3菌株T3SS的表达，其中钙的消耗和高浓度镁离子是诱导T3SS表达最主要的因素，温度升高也能促进其表达。同时，发现嗜水气单胞菌脂多糖结构与T3SS效应蛋白的产生有关，O抗原结构的改变影响细菌表面的亲水特性，从而影响T3SS机制活化的信号感知。鞭毛基因的突变也降低了aopNaopD和aexT 启动子的活性，说明鞭毛和T3SS之间存在交叉调控[54]。RpoN基因对于嗜水气单胞菌AH3 的极性和横向鞭毛的产生是必不可少的。PDHc 基因的突变降低了T3SS的表达，说明PDHc对于T3SS的表达是必不可少的。嗜水气单胞菌AH3株T3SS调节子群体感应系统正向调节T3SS结构蛋白的生成[50]。在诱导T3SS表达的情况下，嗜水气单胞菌AH3 axsA基因突变株的T3SS活性与野生株相比大幅下降，而AxsA与铜绿芽胞杆菌ExsA区域相似[55]，存在类似的结合位点，说明AxsA 是嗜水气单胞菌AH3 株T3SS的主要调节因子。由于T3SS结构基因和aexT基因不在同一基因组区域，所以AxsA的调控是一个通用调控途径，而AopN的缺失打开T3SS通道，激活正向反馈机制，从而激活AxsA，而AxsA促进T3SS的表达[50]。细菌存在一个复杂的调控网络中，能将T3SS的生成和细菌功能联系起来，说明毒力因子表达的精确时间与协调性对于感染过程十分必要。 4 迟缓爱德华氏菌Ⅲ型分泌系統
4.1 迟缓爱德华氏菌T3SS的组成
Tan等[11]利用染色体步移技术和蛋白质组学方法鉴定迟缓爱德华氏菌T3SS基因，鉴定出35个开放阅读框，编码T3SS结构蛋白、分子伴侣、效应蛋白和调节蛋白。迟缓爱德华氏菌T3SS基因与沙门氏菌毒力岛2（SPI2）编码的T3SS基因同源，迟缓爱德华氏菌3种效应蛋白分别与沙门氏菌效应蛋白SseB、C、D同源，于是分别命名为EseB、C、D。T3SS编码区域有30 756 bp，GC含量高于Ed.tarda 染色体组，而SPI2的GC含量则低于染色体组。迟缓爱德华氏菌的效应蛋白基因为eseB、eseC、eseD和eseE，伴侣蛋白基因为escA、escB和escC，双组分调节系统基因为esrA-esrB，转录调节因子基因为esrC。
4.2 迟缓爱德华氏菌T3SS的作用
插入失活调节蛋白基因esrA和esrB，装置蛋白基因esaC，分子伴侣基因escA，分别观察细菌在鱼类巨噬细胞的存活和复制能力、对无吞噬能力的EPC细胞的粘附和内化能力以及鱼类的半数致死量。研究发现，与野生株相比，突变株的存活、复制和杀死鱼类细胞的能力都减弱；esrA 和esrB突变株降低迟缓爱德华氏菌对细胞的粘附和内化能力[17]。李杰等[56] 利用框内缺失突变技术进行esaC定点突变，研究发现esaC基因的缺失影响效应蛋白EseB、EseC和EseD的分泌，但不影响在胞内的表达。这可能是因为esaC的缺失影响迟缓爱德华氏菌T3SS孔道结构的完整性，从而影响蛋白的正常分泌。
Wang Bo[57]等利用框内缺失突变法构建eseD基因突变株，与野生株相比eseD缺失突变株的效应蛋白EseC和EseB分泌水平降低，菌株的群集运动能力和接触溶血能力衰减，但生物膜合成能力增加。互补表达后表型恢复到与野生株类似。侵染试验表明eseD缺失突变株复制能力降低，对鱼类的毒力降低10倍。这些结果表明EseD在E.tarda致病性中有特定作用。插入失活效应蛋白基因eseB，突变株在培养基中的自凝聚能力下降，说明EseB可能是胞外纤毛或者附属物的组成成分。当细菌在中性或碱性环境中培养时，EseB、C、D的分泌量达到最大值。研究发现，包含野生菌的吞噬体呈酸性，而包含T3SS突变体的吞噬体呈碱性，说明T3SS干扰巨噬细胞形成酸性环境对于迟缓爱德华氏菌胞内复制是十分必要的[17]。EseB、EseC和EseD蛋白是E.tarda T3SS输送器的组成成分，在分泌到细菌细胞外后可以组成输送器装置。
分子伴侣对于输送器蛋白的稳定和分泌具有重要的作用。EscC被鉴定为EseB和EseD的伴侣蛋白，并影响EseB和EseD的分泌和稳定性[58]。Okuda J等[59]研究发现伴侣蛋白基因escC和位于T3SS基因簇上的orf13、orf19、orf29和orf30基因对于迟缓爱德华氏菌侵染斑马鱼是必不可少的。
EscA是EseC的分子伴侣并贡献迟缓爱德华氏菌对宿主细胞的毒力。escA基因位于eseC基因上游，框内缺失escA基因的突变株不影响eseC基因的转录，但是通过EseC-LacZ融合蛋白检测到eseC在细胞内的积累水平减少。进一步研究表明，EseC蛋白31～137氨基酸残基对于EseC-EscA的反应不可缺少[60]。
4.3 迟缓爱德华氏菌T3SS的主要调控因子和调控机制
为了生存和适应外界环境的变化，细菌通过一系列的信号转导途径来响应环境信号并对刺激作出应答（图3）。双组分系统（Twocomponent system，TCS）是细菌最关键的信号转导系统，与病原菌在宿主体内外不同环境条件下的适应能力密切相关。迟缓爱德华氏菌TCS协同全局调控蛋白和σ因子等调控元件共同作用。EsrA/EsrB系统调控T3SS蛋白的表达和分泌，值得注意的是EsrB还通过T3SS基因簇编码的AraC家族的调控蛋白EsrC来调控T6SS和部分T3SS基因的表达[61]。此外，发现EsrB协同核酸结合蛋白Hha共同抑制溶血素基因tdhA的表达。迟缓爱德华氏菌EsrB和PhoP为主要的毒力调控因子，PhoP通过2条途径作用毒力：①对T3SS和T6SS的调控；②对CAMP的抵抗。通过对尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶（Ugd）的功能鉴定和表达分析，揭示了PhoP通过调控Ugd介导抵抗宿主阳离子抗菌肽（CAMP）的杀伤作用[62]。 外界环境的变化也影响细菌分泌系统的表达，迟缓爱德华氏菌在感染过程中经历了由环境温度到宿主温度的变化，T3SS受到温度的调控，研究表明在37 ℃条件下细菌生长快，T3SS结构蛋白表达量较低[63]；在28 ℃条件下，T3SS的结构蛋白表达最高。在28和37 ℃的培养条件下，中性和碱性分别适合细菌的生长和T3SS结构蛋白的表达。迟缓爱德华氏菌群体感应系统 QesBQseC影响由鞭毛和纤毛形成的细菌表面结构，并通过介导肾上腺素信号调控鞭毛合成元件及分泌系统元件的表达，影响菌株的运动能力和对宿主细胞的粘附能力[58]。
5 小结
近年来，海水养殖业不断发展，为人们创造巨大经济效益的同时也带来了负面影响，比如细菌病害的泛滥。这是由于目前国内对水产病原菌的治疗主要依靠抗生素，随着抗生素的大量使用，细菌的耐药广谱越来越大，并且引起了环境污染的问题，因此抗生素的作用也受到限制。因此，亟待解决的问题是找到一种环境危害小、方便又高效的方法来防治水产疾病。
副溶血弧菌、嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌都是严重的鱼类致病菌，其中T3SS是重要的毒力因子。自发现T3SS以来，国内外学者对其结构蛋白、分泌蛋白和调控机制等进行了深入研究，认识水平有了很大提高。作为一种病原菌向宿主细胞内靶向转运毒力蛋白的系统，T3SS是病原菌与宿主相互作用的重要界面，当受到接触诱导后分泌多种效应蛋白到宿主细胞，导致一系列细胞效应，如通过抑制细胞信号传导，阻止被感染肌细胞动蛋白的聚集和巨噬细胞肌动蛋白的快速重排，从而抑制巨噬细胞的吞噬；肌动蛋白的变构导致细胞骨架的重排、转录因子的激活、离子通道的刺激、在某些细胞会出现细胞凋亡；抑制NFκB和Rho GTP酶的活性，从而诱导宿主细胞凋亡和肌动蛋白的分解等，分泌和转移过程是由非常复杂的调节机制调控的。这些研究结果对研制新的抗菌感染药物和疫苗等策略提供了可能性。Rosenzweig J A等[16]在评估A.Hydrophila AexU对小鼠毒性和免疫原性的贡献时发现A.hydrophila ΔaexU 突变株对小鼠的致死率明显下降，并且ΔaexU 突变株在被感染的小鼠体内不会扩散到肺和脾脏等器官，rAexU 突变株对小鼠提供保护性免疫原性，试验结果为研发A.Hydrophila疫苗提供了可行性；Xiao J等[64]将E.tarda EIB202突变株WED作为研究对象，WED是将T3SS的eseB、eseC、eseD基因和分枝酸合成基因aroC缺失，并将内源质粒pEIB202去掉的菌株。研究发现WED的半数致死量是野生株的5700倍；将WED作为疫苗接种到大菱鲆5个周后，大菱鲆能够免于E.tarda EIB202野生株毒力因子的作用，产生低水平的特异性抗体和免疫相关因子，结果表明WED作为大菱鲆的活体减毒疫苗具有可行性。 目前，依然存在许多亟待解决的问题（如鉴定出诱导和抑制T3SS表达的环境和宿主信号因子、解释效应蛋白与宿主细胞的相互作用等），对于研究T3SS复杂的调节机制，阐明其致病机理，设计针对T3SS表达的治疗药物和方法，都具有极其重要的意义。
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关键词 革兰氏阴性病原菌；Ⅲ型分泌系统；毒力因子
中图分类号 S917.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）13-156-06
Abstract Many Gramnegative pathogenic bacteria develop their virulence factors or effectors to eukaryotic host cells through their type Ⅲ secretion systems（T3SSs）. Vibrio parahaemolyticus， Edwardsiella tarda and Aeromonas hydrophila are three common Gramnegative pathogens in marine aquaculture， which not only infect aquaculture animals but also cause gastroenteritis in humans. T3SS are suggested to be closely related to bacteria pathogenicity in these three pathogens. The recent progresses in the composition， function and regulation mechanism study of the T3SSs in those three pathogens were summarized.
Key words Gramnegative pathogens； Type Ⅲ secretion system； Virulence factors
海水養殖环境中存在多种具有条件致病性的革兰氏阴性菌，比如副溶血弧菌。副溶血弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，不仅能引起人类食物中毒性肠胃炎，还可引起水生动物（如海鲷、对虾、九孔鲍、文蛤等[1]）疾病。嗜水气单胞菌属于弧菌科气单胞菌属，在自然界广泛分布，可以感染多种水生及陆生动物，是一种重要的人、兽、鱼共患病病原菌[2]。迟缓爱德华氏菌是一种革兰氏阴性肠道病原菌，感染宿主范围广，在水产养殖生物中该菌是鱼类鳗、鲇和鲆等的重要致病菌[3]。目前，对病原菌的致病机理研究较多，溶血素、粘附因子和胞外蛋白等多种胞外物质被认为与病原菌的毒力有关，然而这些毒力因子不足以引起严重的致病症状，可能存在其他毒力较强的致病因子[4-6]。关于细菌毒力因子的鉴定和特征分析已取得许多进展，尽管如此不同毒力因子之间的联系以及进入宿主细胞的顺序仍然未确定[7]。
细菌分泌系统的发现是近年来细菌致病机制研究的重要进展。系统发育和遗传进化分析表明，细菌是通过几种分泌机制将蛋白性质的毒力因子分泌出去的。到目前为止，共发现7种类型的分泌系统，它们以各自特有的方式参与细菌的致病过程[8]。其中，Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion system，T3SS）与动植物革兰阴性病原菌的毒力因子分泌有关，因此备受关注。Ⅲ型分泌系统首次发现于小肠结肠炎耶尔森菌中，由George P.C.Salmond和Philip J.Reeves [9]于1993年首次命名，该系统广泛存在于革兰氏阴性菌（如志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、弧菌、假单胞菌和植物病原菌欧文氏菌属、黄单胞菌属等）中。海水环境中的某些革兰阴性病原菌中也发现具有T3SS系统，KwonSam Park等[10]证实副溶血弧菌T3SS具有对真核细胞的细胞毒性和肠毒性；Tan等[11]发现将迟缓爱德华氏菌T3SS相关基因突变后，突变株在鱼类巨噬细胞中的存活、复制和杀死鱼类细胞的能力都减弱；G.A.CarvalhoCastro等[12]利用PCR 技术检测从病鱼中分离的嗜水气单胞菌的T3SS，结果表明完整T3SS的存在增加了嗜水气单胞菌的毒性。多位生物学家通过试验证实副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的Ⅲ型分泌系统对真核细胞有较强的细胞毒性[13-16]，Ⅲ型分泌系统的存在与否直接影响病原菌的毒性强弱[15，17-18]。
笔者以副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌3种水产养殖环境中常见的革兰阴性病原菌为研究对象，对其Ⅲ型分泌系统的组成、相关结构蛋白、效应蛋白的功能以及相关表达调控过程的研究进展进行了综述。
1 Ⅲ型分泌系统
Ⅲ型分泌系统存在于革兰氏阴性菌中，广泛参与革兰氏阴性菌毒力因子的分泌，编码T3SS的基因通常成簇地以毒力岛（Pathogenicity island，PI）的形式存在于细菌的染色体或质粒上。与基因组其他部分相比，该分泌系统基因的GC含量较低或较高，目前认为是可转移的外源基因插入成分，通过水平传递而获得[19]。
所有已知动植物致病菌的Ⅲ型分泌系统都有许多高度保守的主要结构成分。Ⅲ型分泌系统由20种以上的蛋白质组成，是所有已知的蛋白质分泌系统中最复杂的[20]，其组分包括分泌蛋白、伴侣蛋白、结构蛋白和调节蛋白。调节蛋白对Ⅲ型分泌系统的基因表达起调节作用。分泌蛋白需要小的、通常是酸性、位于细胞质膜的附属蛋白，特异性地与之结合，这种附属蛋白质被称为伴侣蛋白[21]。分子伴侣能够稳定细胞质内相应的底物，阻止相应底物自身及其他效应蛋白或转位子蛋白未成熟前的同种或异种蛋白的结合，这种结合可能会导致结合蛋白的失活[22]。 Ⅲ型分泌系统的外排装置由几种完整的膜蛋白组成，横跨细胞内、外膜，并延伸形成一个针状结构通向胞外。各菌的Ⅲ型分泌系统在分泌功能上具有相似性，组织结构上却各有不同。虽然Ⅲ型分泌系统附属组件的结构和对称性是多元化的，但研究表明这些系统是由同源蛋白分子组装而成[23]。从图1可以看出，通用结构为多环基底结构嵌入内、外膜和细胞周质间隙中，基底端与胞内的外排装置和复杂ATP酶系统接触，末端针状的结构转运毒力蛋白，通过周质和胞外环境直接进入宿主细胞。Ⅲ型分泌系统分泌装置与鞭毛结构上有相似之处，可能由细菌鞭毛进化而来[24]。
Ⅲ型分泌系统受到接触诱导后分泌与毒力有关的多种蛋白质注入宿主细胞内，这些蛋白称为效应蛋白。Ⅲ型分泌系统可释放几种效应蛋白，刺激宿主细胞的信号转导途径，导致一系列的细胞效应[9]，如肌动蛋白的变构导致细胞骨架的重排、转录因子的激活、离子通道的刺激、在某些细胞会出现细胞凋亡等。这个分泌和转移过程是由非常复杂的转录和转录后的机制调控的。
2 副溶血弧菌的Ⅲ型分泌系统
2.1 副溶血弧菌T3SS的组成
2002年Tagomori [25]完成第1株副溶血弧菌全基因组测序，发现该菌含有2套Ⅲ型分泌系统（T3SS），分别为T3SS1和T3SS2，后者是关键的毒力系统，可以细分为T3SS2ɑ和T3SS2β。T3SS1位于染色体1上，有30个开放阅读框，序列与其他革兰氏阴性菌的T3SS相关基因有一定同源性。T3SS1存在于所有的副溶血弧菌分离株中，其GC含量与基因组其他区域有差别，被认为是该菌的遗传标记之一[26]。T3SS1的分泌装置由一系列结构蛋白组成，包括内膜蛋白VcrD1、外膜蛋白VscC1以及细胞周质蛋白VscN1[10]。 Ono T[13]等利用二维凝胶电泳对副溶血弧菌T3SS1突变株及其亲本株的分泌蛋白进行了对比分析，发现了T3SS1的4个分泌蛋白，分别为VP1656（VopD）、VP1680、VP1686和VPA450。Waddell B等[27]鉴定出VPA0451是VPA0450的特异性分子伴侣。VPA0451与已知的T3SS1分子伴侣结构相似，VPA0450转运进入宿主细胞需要VPA0451的协助。VPA0451直接结合于VPA0450，25～100位氨基酸是VPA0451的活性部位。因此，确定VPA0451是迄今为止发现的T3SS1的第2个分子伴侣。
T3SS2位于染色体2的毒力岛上[28]。副溶血弧菌KP+株拥有2种tdh基因，分别是tdhA和tdhS，不能同时拥有trh基因[29-31]；KP-株则拥有trh基因或者trh和tdh基因[10，32]。Okada N 等[33]对trh+副溶血弧菌TH3996株测序，发现在trh基因附近100 kb左右的DNA区域存在1种新的T3SS基因，经过动物试验及PCR分析发现这种T3SS基因存在于所有的被检测的trh+菌株中，并且对于细菌的胞外毒性必不可少，系统进化分析表明这种T3SS与KP+的T3SS2虽然有很近的关系，但却属于不同的系，这种新的T3SS2即T3SS2β。拟态弧菌和霍乱弧菌也存在T3SS2ɑ和T3SS2β基因，并且拟态弧菌与霍乱弧菌的关系更近。拟态弧菌和霍乱弧菌的T3SS2基因可能是通过水平基因转移得到的[34]。与T3SS1相似，副溶血弧菌vcrD2、vscC2和vscN2分别编码了T3SS2的内膜蛋白，外膜蛋白和细胞周质蛋白[10]。ZHOU等[28]用二维凝胶电泳方法对亲本株（敲除T3SS1结构基因vscN1的菌株）和突变株（敲除掉T3SS1和T3SS2的结构基因vscN1、vscN2的菌株）所分泌的蛋白进行对比分析，其中VopL、 VopT、VopA、VopV 和 VopC是已知的效应蛋白，VopB2、 VopD2 和VopW是T3SS2易位子的组成部分，是分泌装置的一部分，VopcC 是VopC的分子伴侣，另外还有VPA1336（VopZ）、 VPA1350、VPA1343；VPA1343 是T3SS2的分泌装置，VPA1350在转运过程中起结构或调节作用。Akeda Y等[35]研究发现VocC是T3SS2效应蛋白VopC和VopL的分子伴侣。
2.2 副溶血弧菌T3SS的作用
副溶血弧菌T3SS1主要贡献对宿主细胞的细胞毒性，介导宿主细胞的自体吞噬作用，最后导致细胞死亡。T3SS1的分泌蛋白中VopQ/A（VP1680）是T3SS1介導真核细胞毒性的最主要蛋白，具有对Hela细胞的细胞毒性。Sreelatha A等[36]研究表明即使环境中存在自噬的化学抑制剂，VopQ也足以引发宿主细胞的快速自噬，VopQ在溶酶体膜表面形成小孔，使溶酶体释放小于350 D的分子，从而诱导宿主细胞自噬。VopD也具有对Hela细胞的毒性，此外还具有溶血活性。VP1686不仅能通过抑制NFJB的活性来介导巨噬细胞死亡[37]，还能通过抑制RhoB的鸟苷三磷酸酶及下游的信号传导，阻止被感染细胞肌动蛋白的聚集和巨噬细胞肌动蛋白的快速重排，有助于抵抗巨噬细胞对病原菌的吞噬作用[38-40]。
副溶血弧菌T3SS2位于染色体2的毒力岛上，具有肠毒性。目前共鉴定出6种副溶血弧菌T3SS2的效应蛋白，VopA能活化激酶催化环结构中保守的赖氨酸乙酰化，阻止ATP的结合，最终阻止激酶的磷酸化[41]。VopT（VPA1327）具有核糖转移酶活性，部分贡献T3SS2对Caco2的细胞毒性[14]。VopL（VPA1370）能诱导肌动蛋白抗压纤维的形成，并加速肌动蛋白纤维丝的聚集[42]。VopC（VPA1321）与大肠杆菌细胞毒性坏死因子的同源性达38%[43]。Zhou等[28]首次阐明了VopZ在诱导腹泻中发挥独特作用，VopZ抑制丝裂原活化蛋白激酶MAP3K7（TAK1）的启动，控制MAPK和 NFκB信号传导途径，从而抑制细胞分裂。此外，N末端玻尿酸标记的VopZ能够在Hela细胞表面形成小孔。因此，VopZ对副溶血弧菌在肠道内的增殖作用不大，而有助于该菌在肠道内引起腹泻和组织破坏等疾病。 副溶血弧菌T3SS2效应蛋白分泌到宿主细胞中需要通过3种蛋白质形成的膜通道，分别为转运蛋白 VopB2、VopD2和VopW。Zhou X等[18]研究表明VopW帮助另外2种蛋白质插入宿主细胞膜形成膜通道，对效应蛋白分泌到宿主细胞必不可少。利用vopW基因的缺失菌株感染动物，发现菌株无法转运已知的T3SS2分泌蛋白到宿主细胞中，也无法检测到其他转运蛋白插入到宿主细胞膜中，而且在感染动物模型试验中缺失株是无毒的，这些结果结合VopW的大小和预测的二级结构，揭示VopW是副溶血弧菌的亲水性转运成分，引导VopD2 和VopB2 组装并插入到宿主细胞膜孔。另外，VopW自身可以转运到宿主细胞的细胞质，可能既是转运蛋白又是效应蛋白。
2.3 副溶血弧菌T3SS的主要调控因子及调控机制
副溶血弧菌ExsA与ExsD能够调控T3SS1基因簇的转录表达，ExsA为正向转录调控，ExsD为负向转录调控[44]。Zhou X等[45]通过不同抗原标记的重组蛋白共表达试验表明ExsC结合ExsD，并且ExsC的N末端对结合十分必要。抗原标记的ExsA和ExsD的共表达和纯化试验表明ExsD直接结合ExsA，猜测这种结合阻止了ExsA与T3SS1基因启动区的结合。总体而言，这些试验结果说明ExsD 结合ExsA阻止T3SS1的表达，ExsC结合ExsD 释放ExsA，从而允许T3SS1的表达，副溶血弧菌ExsA、ExsC和ExsD与铜绿假单胞菌调节因子在功能上有直系同源性。
3 嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统
3.1 嗜水气单胞菌T3SS的组成
Yu等[46]首次报道了嗜水气单胞菌AH1株中存在T3SS，利用基因步移法克隆了全长的T3SS序列，其中包括5个启动子和25个开放阅读框表达25种T3SS组分蛋白。AexT和AexU是嗜水气单胞菌的效应蛋白。AopN 蛋白是T3SS的重要组成部分，它是外在膜蛋白，ascV和aopB基因的编码产物是嗜水气单胞菌T3SS的必要构成成分，前者编码与T3SS固定在细菌内膜有关的蛋白，后者编码的蛋白是易位子的组装成分。Sha等[47]根据耶尔森菌T3SS基因yscV设计探针，在嗜水气单胞菌人源腹泻分离株SSU基因组文库中检测到全长26 855 bp的T3SS，共35个开放阅读框。通过对嗜水气单胞菌AH1株和SSU株的T3SS序列的比较发现，二者的同源性不高。基因序列的变化可能会改变蛋白质构象，从而产生不同的效应蛋白和结构蛋白，这也解释了虽然包括无毒株在内的许多嗜水气单胞菌都含有T3SS，但其结构不完全相同，也许决定了它們毒力方面的差异。
3.2 嗜水气单胞菌T3SS的作用
现已证实，嗜水气单胞菌存在2个效应蛋白（AexT[43，48]和AexU），杀鲑气单胞菌存在4个效应蛋白（AexT[49]、AopP[50]、AopH和AopO）。AexT是嗜水气单胞菌中发现的第1个效应蛋白，也是最小的效应蛋白。Vilches S等[45]对嗜温的嗜水气单胞菌AH3 株T3SS分泌的ADP核糖基化毒素（AexT）进行克隆和测序，发现AexT与杀鲑气单胞菌AexT的前半部分具有同源性。AexT具有ADP核糖转移酶活性，aexT基因缺失株的毒性与野生株相比轻微减小，而T3SS基因缺失株的毒性则大大降低。
Sierral等[15]证实嗜水气单胞菌SSU株AexU作为ADP核糖化转移酶和GTP酶活化蛋白，参与宿主细胞的凋亡和肌动蛋白的分解，AexU可以阻止cJun、JNK和JκB的磷酸化并抑制Hela细胞1L6和1L8的分泌，从而抑制NFκB和Rho GTP酶的活性。AexU与铜绿假单胞菌ExoT/S同源，氨基末端与耶尔森氏菌YopE活性相似，AexU 约有67%的序列与 AexT相似，然而其羧基端序列不与任何已知的蛋白质序列同源[44]。AexU羧基端的单核苷酸替换率约为17%，而AexT则要保守得多，其单核苷酸替换率在4%左右，或许AexU羧基端是独立于氨基端进化的，这不仅能产生不同的等位基因，而且产生多种 AexU效应蛋白以适应宿主体内不断变化的环境。此外，温和气单胞菌AexU共定位β4整合蛋白，产生应对宿主细胞的细胞毒素[51]。
ascV和aopB基因是嗜水气单胞菌T3SS的必要构成成分，前者编码与T3SS固定在细菌内膜有关的蛋白，后者编码的蛋白是易位子的组装成分。G.A.Carvalho Castro等[12]利用PCR技术从T3SS中检测ascV和aopB基因，估测2种基因在嗜水气单胞菌病原菌和环境分离株中的频率，2种基因有3种存在方式：ascV+/aopB+、ascV+/aopB-和ascV-/aopB-。检测到的64株病鱼分离菌ascV+/aopB+频率最高（62.5%），说明ascV+/aopB+病原菌能够引起鱼类极高的死亡率。环境分离株虽然有T3SS结构，但是毒力很低。PCR技术可以有效鉴定T3SS，并且可以将嗜水气单胞菌的毒力因子进行分类。谢振宣等[52]利用自杀性质粒成功构建了嗜水气单胞菌J1株ascV基因的缺失突变株，该突变株许多胞外产物缺失，毒力消失，说明AscV在嗜水气单胞菌J1株的致病过程中发挥重要作用。
3.3 嗜水气单胞菌T3SS的主要调控因子及调控机制
从图2可以看出，嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统的表达与其他毒力因子之间存在复杂的联系，如脂多糖、ahyIR群体感应系统、PhoPQ双组份系统和复杂的丙酮酸脱氢酶等。PhoPQ系统对胞外镁离子浓度敏感，低浓度镁离子激活PhoPQ的转录，高浓度则抑制其转录，PhoPQ抑制T3SS的表达。为了研究嗜水气单胞菌T3SS在体内的表达，Vilches S等[53]用绿色荧光蛋白标记和实时定量PCR方法分析aopNaopD和aexT基因启动区的活性，结果发现环境因子诱导嗜水气单胞菌AH3菌株T3SS的表达，其中钙的消耗和高浓度镁离子是诱导T3SS表达最主要的因素，温度升高也能促进其表达。同时，发现嗜水气单胞菌脂多糖结构与T3SS效应蛋白的产生有关，O抗原结构的改变影响细菌表面的亲水特性，从而影响T3SS机制活化的信号感知。鞭毛基因的突变也降低了aopNaopD和aexT 启动子的活性，说明鞭毛和T3SS之间存在交叉调控[54]。RpoN基因对于嗜水气单胞菌AH3 的极性和横向鞭毛的产生是必不可少的。PDHc 基因的突变降低了T3SS的表达，说明PDHc对于T3SS的表达是必不可少的。嗜水气单胞菌AH3株T3SS调节子群体感应系统正向调节T3SS结构蛋白的生成[50]。在诱导T3SS表达的情况下，嗜水气单胞菌AH3 axsA基因突变株的T3SS活性与野生株相比大幅下降，而AxsA与铜绿芽胞杆菌ExsA区域相似[55]，存在类似的结合位点，说明AxsA 是嗜水气单胞菌AH3 株T3SS的主要调节因子。由于T3SS结构基因和aexT基因不在同一基因组区域，所以AxsA的调控是一个通用调控途径，而AopN的缺失打开T3SS通道，激活正向反馈机制，从而激活AxsA，而AxsA促进T3SS的表达[50]。细菌存在一个复杂的调控网络中，能将T3SS的生成和细菌功能联系起来，说明毒力因子表达的精确时间与协调性对于感染过程十分必要。 4 迟缓爱德华氏菌Ⅲ型分泌系統
4.1 迟缓爱德华氏菌T3SS的组成
Tan等[11]利用染色体步移技术和蛋白质组学方法鉴定迟缓爱德华氏菌T3SS基因，鉴定出35个开放阅读框，编码T3SS结构蛋白、分子伴侣、效应蛋白和调节蛋白。迟缓爱德华氏菌T3SS基因与沙门氏菌毒力岛2（SPI2）编码的T3SS基因同源，迟缓爱德华氏菌3种效应蛋白分别与沙门氏菌效应蛋白SseB、C、D同源，于是分别命名为EseB、C、D。T3SS编码区域有30 756 bp，GC含量高于Ed.tarda 染色体组，而SPI2的GC含量则低于染色体组。迟缓爱德华氏菌的效应蛋白基因为eseB、eseC、eseD和eseE，伴侣蛋白基因为escA、escB和escC，双组分调节系统基因为esrA-esrB，转录调节因子基因为esrC。
4.2 迟缓爱德华氏菌T3SS的作用
插入失活调节蛋白基因esrA和esrB，装置蛋白基因esaC，分子伴侣基因escA，分别观察细菌在鱼类巨噬细胞的存活和复制能力、对无吞噬能力的EPC细胞的粘附和内化能力以及鱼类的半数致死量。研究发现，与野生株相比，突变株的存活、复制和杀死鱼类细胞的能力都减弱；esrA 和esrB突变株降低迟缓爱德华氏菌对细胞的粘附和内化能力[17]。李杰等[56] 利用框内缺失突变技术进行esaC定点突变，研究发现esaC基因的缺失影响效应蛋白EseB、EseC和EseD的分泌，但不影响在胞内的表达。这可能是因为esaC的缺失影响迟缓爱德华氏菌T3SS孔道结构的完整性，从而影响蛋白的正常分泌。
Wang Bo[57]等利用框内缺失突变法构建eseD基因突变株，与野生株相比eseD缺失突变株的效应蛋白EseC和EseB分泌水平降低，菌株的群集运动能力和接触溶血能力衰减，但生物膜合成能力增加。互补表达后表型恢复到与野生株类似。侵染试验表明eseD缺失突变株复制能力降低，对鱼类的毒力降低10倍。这些结果表明EseD在E.tarda致病性中有特定作用。插入失活效应蛋白基因eseB，突变株在培养基中的自凝聚能力下降，说明EseB可能是胞外纤毛或者附属物的组成成分。当细菌在中性或碱性环境中培养时，EseB、C、D的分泌量达到最大值。研究发现，包含野生菌的吞噬体呈酸性，而包含T3SS突变体的吞噬体呈碱性，说明T3SS干扰巨噬细胞形成酸性环境对于迟缓爱德华氏菌胞内复制是十分必要的[17]。EseB、EseC和EseD蛋白是E.tarda T3SS输送器的组成成分，在分泌到细菌细胞外后可以组成输送器装置。
分子伴侣对于输送器蛋白的稳定和分泌具有重要的作用。EscC被鉴定为EseB和EseD的伴侣蛋白，并影响EseB和EseD的分泌和稳定性[58]。Okuda J等[59]研究发现伴侣蛋白基因escC和位于T3SS基因簇上的orf13、orf19、orf29和orf30基因对于迟缓爱德华氏菌侵染斑马鱼是必不可少的。
EscA是EseC的分子伴侣并贡献迟缓爱德华氏菌对宿主细胞的毒力。escA基因位于eseC基因上游，框内缺失escA基因的突变株不影响eseC基因的转录，但是通过EseC-LacZ融合蛋白检测到eseC在细胞内的积累水平减少。进一步研究表明，EseC蛋白31～137氨基酸残基对于EseC-EscA的反应不可缺少[60]。
4.3 迟缓爱德华氏菌T3SS的主要调控因子和调控机制
为了生存和适应外界环境的变化，细菌通过一系列的信号转导途径来响应环境信号并对刺激作出应答（图3）。双组分系统（Twocomponent system，TCS）是细菌最关键的信号转导系统，与病原菌在宿主体内外不同环境条件下的适应能力密切相关。迟缓爱德华氏菌TCS协同全局调控蛋白和σ因子等调控元件共同作用。EsrA/EsrB系统调控T3SS蛋白的表达和分泌，值得注意的是EsrB还通过T3SS基因簇编码的AraC家族的调控蛋白EsrC来调控T6SS和部分T3SS基因的表达[61]。此外，发现EsrB协同核酸结合蛋白Hha共同抑制溶血素基因tdhA的表达。迟缓爱德华氏菌EsrB和PhoP为主要的毒力调控因子，PhoP通过2条途径作用毒力：①对T3SS和T6SS的调控；②对CAMP的抵抗。通过对尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶（Ugd）的功能鉴定和表达分析，揭示了PhoP通过调控Ugd介导抵抗宿主阳离子抗菌肽（CAMP）的杀伤作用[62]。 外界环境的变化也影响细菌分泌系统的表达，迟缓爱德华氏菌在感染过程中经历了由环境温度到宿主温度的变化，T3SS受到温度的调控，研究表明在37 ℃条件下细菌生长快，T3SS结构蛋白表达量较低[63]；在28 ℃条件下，T3SS的结构蛋白表达最高。在28和37 ℃的培养条件下，中性和碱性分别适合细菌的生长和T3SS结构蛋白的表达。迟缓爱德华氏菌群体感应系统 QesBQseC影响由鞭毛和纤毛形成的细菌表面结构，并通过介导肾上腺素信号调控鞭毛合成元件及分泌系统元件的表达，影响菌株的运动能力和对宿主细胞的粘附能力[58]。
5 小结
近年来，海水养殖业不断发展，为人们创造巨大经济效益的同时也带来了负面影响，比如细菌病害的泛滥。这是由于目前国内对水产病原菌的治疗主要依靠抗生素，随着抗生素的大量使用，细菌的耐药广谱越来越大，并且引起了环境污染的问题，因此抗生素的作用也受到限制。因此，亟待解决的问题是找到一种环境危害小、方便又高效的方法来防治水产疾病。
副溶血弧菌、嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌都是严重的鱼类致病菌，其中T3SS是重要的毒力因子。自发现T3SS以来，国内外学者对其结构蛋白、分泌蛋白和调控机制等进行了深入研究，认识水平有了很大提高。作为一种病原菌向宿主细胞内靶向转运毒力蛋白的系统，T3SS是病原菌与宿主相互作用的重要界面，当受到接触诱导后分泌多种效应蛋白到宿主细胞，导致一系列细胞效应，如通过抑制细胞信号传导，阻止被感染肌细胞动蛋白的聚集和巨噬细胞肌动蛋白的快速重排，从而抑制巨噬细胞的吞噬；肌动蛋白的变构导致细胞骨架的重排、转录因子的激活、离子通道的刺激、在某些细胞会出现细胞凋亡；抑制NFκB和Rho GTP酶的活性，从而诱导宿主细胞凋亡和肌动蛋白的分解等，分泌和转移过程是由非常复杂的调节机制调控的。这些研究结果对研制新的抗菌感染药物和疫苗等策略提供了可能性。Rosenzweig J A等[16]在评估A.Hydrophila AexU对小鼠毒性和免疫原性的贡献时发现A.hydrophila ΔaexU 突变株对小鼠的致死率明显下降，并且ΔaexU 突变株在被感染的小鼠体内不会扩散到肺和脾脏等器官，rAexU 突变株对小鼠提供保护性免疫原性，试验结果为研发A.Hydrophila疫苗提供了可行性；Xiao J等[64]将E.tarda EIB202突变株WED作为研究对象，WED是将T3SS的eseB、eseC、eseD基因和分枝酸合成基因aroC缺失，并将内源质粒pEIB202去掉的菌株。研究发现WED的半数致死量是野生株的5700倍；将WED作为疫苗接种到大菱鲆5个周后，大菱鲆能够免于E.tarda EIB202野生株毒力因子的作用，产生低水平的特异性抗体和免疫相关因子，结果表明WED作为大菱鲆的活体减毒疫苗具有可行性。 目前，依然存在许多亟待解决的问题（如鉴定出诱导和抑制T3SS表达的环境和宿主信号因子、解释效应蛋白与宿主细胞的相互作用等），对于研究T3SS复杂的调节机制，阐明其致病机理，设计针对T3SS表达的治疗药物和方法，都具有极其重要的意义。
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