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摘要[目的]研究离子液体1乙基3甲基咪唑磷酸二乙酯磷酸盐（〔Emim〕DEP）对酿酒酵母SY101生长的影响。[方法]用显微镜观察了不同〔Emim〕DEP浓度下液体培养基中对数生长期酵母细胞的形态及出芽情况，用分光光度法测得的数值绘制出酵母菌24 h生长曲线。[结果]试验发现，〔Emim〕DEP对酿酒酵母SY101生长有抑制性，随着〔Emim〕DEP浓度的增加，抑制作用越明显。当〔Emim〕DEP浓度高于3 g/L 时，酵母菌的形态发生明显改变；浓度高于10 g/L 时，酵母菌的出芽率明显下降。通过平板培养测得〔Emim〕DEP对酵母菌的半有效浓度EC50值为6.67 g/L 。[结论] 研究可为由离子液体从农林废弃物中制备纳米纤维素后的残渣发酵燃料酒精的研究提供基础数据。
关键词 离子液体〔Emim〕DEP；酿酒酵母SY101；生长影响；EC50
中图分类号S188+.4文献标识码A文章编号0517-6611（2014）29-10299-03
基金项目海南省自然科学基金项目《TiO2/纤维素纳米复合膜材料的制备及其吸附性能研究》（514218）；中国热带农业科学院院本级基本科研业务费专项资金项目（1630062013012）。
作者简介王晓芳（1982- ），女，安徽定远人，助理研究员，硕士，从事食品工程及微生物发酵方面的研究。
离子液体又称低温熔融盐，作为一种新兴的绿色溶剂，其巨大的应用潜力已在整个科学界达成共识[1]。纳米纤维素作为功能材料，其表现出的高比表面积及高强度等优良特性，日益受到各界的广泛关注，蕴藏着无限商机和美好的发展前景。农林废弃物中含有大量优质纤维素[2]，是制备纳米纤维素的丰富原料，且绿色环保[3]。目前从农林废弃物中提取纳米纤维素的方法有化学处理法、酶解法、生物（细菌）制备法、物理法、人工合成法[4]以及离子液体均相制备法，其中用离子液体均相法制备纳米纤维素是一种工艺简单、环境友好的纳米纤维素制备方法[5]。制备纳米纤维素后剩余的残渣中仍然残留大量的纤维素，转换为可还原糖后可被酿酒酵母发酵生产生物乙醇，有效提高农林废弃物综合利用率。但离子液体对酿酒酵母生长繁殖的影响等情况鲜有报道，笔者初步研究了离子液体1乙基3甲基咪唑磷酸二乙酯磷酸盐（〔Emim〕DEP）对酿酒酵母SY101（Saccharomyces cerevisiae SY101）生长的影响，观察了对数生长期〔Emim〕DEP对该菌细胞的形态结构和出芽率的影响，寻找〔Emin〕DEP对酿酒酵母菌的半有效浓度（EC50），旨在为由离子液体从农林废弃物中制备纳米纤维素后的残渣发酵燃料酒精的研究提供基础数据。
1材料与方法
1.1供试菌株与材料试验菌株酿酒酵母SY101（Saccharomyces cerevisiae SY101），由中国热带农业科学院农产品加工研究所实验室保藏；离子液体〔Emin〕DEP由中国热带农业科学院农产品加工研究所实验室制备，纯度达95%；其他试剂为国产分析纯。
1.2试验方法所有试验均重复4次，文中给出的数据为4次试验的平均值，试验相对误差控制在5%以内。
1.2.1菌种培养基的制备。取保存于低温冰箱的酿酒酵母菌株接种于100 ml（装于250 ml锥形瓶）灭菌的液体YPD培养基中，置于恒温振荡培养箱30 ℃、200 r/min活化24 h，活化的菌液稀释6倍后接种于YPD平板培养基中，置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h，挑取单个菌落接种于100 ml锥形瓶（容量为250 ml）液体YPD培养基中，置于振荡恒温箱30 ℃、振幅5 cm、转速为200 r/min培养24 h活化。该菌液用于后续试验中的平板培养、液体悬浮培养的菌种。该试验过程中所用到的培养基的组成：YPD平板培养基，酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂粉20 g/L；YPD液体培养基，酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。上述培养基根据需要，在其中加入适量的离子液体〔Emim〕DEP，121 ℃灭菌20 min。
1.2.2〔Emin〕DEP对酵母菌SY101在平板培养基生长影响的测定。无菌操作下将上述活化后的酵母菌液10倍梯度稀释6次（经多次涂布经验得出稀释6次后的效果较好）。然后吸取200 μl不同浓度的菌液均匀地涂布到含有〔Emim〕DEP浓度分别为0、0.01、0.10、1.00、3.00、5.00、10.00、12.00 g/L的YPD平板培养基，30 ℃恒温培养48 h，观察记录每个平板中的菌落数（CFU）及菌落直径。
1.2.3〔Emin〕DEP对酵母菌SY101在液体培养基生长影响的测定。同“1.2.2”，各取1.0 ml上述活化的酿酒酵母菌液无菌操作加入分别装有不同浓度〔Emin〕DEP的99 ml YPD液体培养基的250 ml锥形瓶中，然后30 ℃、200 r/min的恒温振荡培养24 h。YPD液体培养基中设置〔Emin〕DEP的浓度梯度分别为0、0.01、0.10、1.00、3.00、5.00、10.00、12.00 g/L。培养过程中，间隔一定时间分别取样（前期12 h每隔2 h，后期12 h每隔4 h）。将样品用无菌水稀释10倍后，以未加药物和酵母菌的液体YPD培养基为对照，用722型分光光度计分别测定其在600 nm处的吸光度值（OD600 nm），再以培养时间（h）为横坐标、OD600 nm为纵坐标绘制其24 h的生长曲线[6]。
2结果与分析
2.1离子液体〔Emin〕DEP对酿酒酵母SY101菌落的半效应浓度（EC50）及菌落生长直径的影响半有效浓度（EC50）是毒性研究中的重要指标，可以比较快速地判断被试药物对微生物可能产生的影响，为进一步作慢性毒性研究提供依据。表1给出了不同〔Emin〕DEP的YPD平板培养基上酵母菌SY101培养48 h后的菌落形成单位数（CFU）及平均菌落直径。由表1可知，当〔Emin〕DEP浓度高于12.00 g/L时，该酵母菌的平板上就不再出现生长菌落，且随着〔Emin〕DEP浓度的增加，菌落数在不断减少，单个菌落直径也在不断减小（图1），这也从侧面佐证了〔Emin〕DEP对该酵母菌有抑制作用，当〔Emin〕DEP浓度达到3.00 g/L时，抑制作用趋于明显。通过对表1的数据进行拟合，得到〔Emin〕DEP对该菌的毒力回归方程Y=2.115 6X+0.897 9，R2=0.952 1，得出〔Emin〕DEP对酵母菌SY101的半有效浓度EC50为6.67 g/L（即在平板培养时CFU数为空白对照一半所对应的〔Emin〕DEP浓度）。华中农业大学微生物学国家重点实验室的刘洋洋等于2012年8月份发表的文章称：当离子液体氯化1丁基3甲基咪唑〔Bmim〕Cl浓度为5.000 mg/ml时，酿酒酵母AS2.399在液体YPD培养基中的浓度为对照组的57%[7]；余培等于2013年11月份报道，1乙基3甲基咪唑醋酸盐〔Emin〕AC对酵母菌AY93161的半有效浓度EC50为4.45 g/L[8]。与上述数据进行比较后可得出，〔Emin〕DEP对酵母菌的毒性较温和。 2.2不同离子液体〔Emin〕DEP浓度梯度下的酿酒酵母SY101的生长曲线如图2所示，酵母菌SY101的生长曲线随着〔Emin〕DEP浓度的不同而变化，当〔Emin〕DEP浓度低于5.00 g/L时，酵母菌的生长曲线有着明显的迟滞期、对数期、稳定期和衰退期；当浓度达到及高于10.00 g/L时，曲线变化不明显，浓度达到12.00 g/L时，菌体生长被严重抑制，在培养基中的增幅很小。分析认为，高浓度〔Emin〕DEP抑制了该菌的生长繁殖，从而降低培养液中的菌体浓度，反映在生长曲线上则提前进入稳定期。说明〔Emin〕DEP对酵母菌的生长有抑制作用，且随着浓度的加大，抑制作用逐步加强。
2.3离子液体〔Emin〕DEP对酵母菌SY101形态及出芽率的影响根据绘制出的酵母菌SY101在24 h内的生长曲线图（图2）可以直观地看出，该酵母菌的对数生长期约在培养后的8～10 h，此时的菌体活力最佳。将上述不同浓度梯度〔Emin〕DEP培养液的对数生长期样品于显微镜（粤显牌L3200型）的40倍视野下观察该酵母菌的细胞形态和出芽情况（图3）。
由图3可知，随着〔Emin〕DEP浓度的增加，酵母菌SY101的单细胞形态逐渐由椭圆形变得圆润，出芽率也随之下降。当〔Emin〕DEP 浓度达到3.00 g/L时，酵母菌的单细胞形态明显变圆，说明高浓度〔Emin〕DEP会导致该酵母菌的形态发生变化。在〔Emin〕DEP浓度达到10.00 g/L时，酵母菌的出芽率明显下降，说明高浓度的〔Emin〕DEP会抑制该酵母菌的增殖力。由上所述，分析认为有可能是高浓度的〔Emin〕DEP引起高渗透压，导致该酵母菌新陈代谢紊乱，影响其细胞壁的结构，从而使酵母菌活力下降。图3不同〔Emin〕DEP浓度梯度液体YPD培养基中酿酒酵母SY101的形态和出芽情况3结论
该研究设置了单因素试验，考察了离子液体〔Emin〕DEP对酿酒酵母SY101生长繁殖的影响，主要结论如下： ① 离子液体〔Emin〕DEP浓度低时，不会改变酵母菌单细胞的形态结构和出芽率，浓度增大时会使单细胞形态变得圆润，该酵母菌的出芽率也会随着〔Emin〕DEP浓度升高而降低。② 离子液体〔Emin〕DEP对酿酒酵母SY101的半有效浓度EC50为6.67 g/L。相比较于其他咪唑类离子液体（如〔Emin〕AC对酿酒酵母AY93161的半有效浓度EC50为4.45 g/L），〔Emin〕DEP对该酵母菌的毒性较小，说明〔Emin〕DEP是一种毒性较温和的离子液体，作为溶剂从废弃农作物纤维中提取纳米纤维素后，残留的离子液体（一般浓度会大于10 g/L）会对后续的酒精发酵产生影响，需要经过处理，降低其浓度才能接种酵母进行发酵利用。
参考文献
[1] 刘传富，张爱萍，李维英，等.纤维素在新型绿色溶剂离子液体中的溶解和应用[J].化学进展，2009，21（9）：1800-1806.
[2] 沈琦，王敏，艾宁，等.农林废弃物成分分析及其综合利用前景展望[J].可再生能源，2009，27（1）：58-61.
[3] 付调坤，魏晓奕，李积华，等.热带农作物废弃物制备天然纳米纤维素的研究进展[J].纤维素科学与技术，2013，21（1）：78-85.
[4] 叶代勇.纳米纤维素的制备[J].化学进展，2007，19（10）：1568-1575.
[5] 李积华，魏晓奕，陈家翠，等.一种均相法制备纳米纤维素的方法：中国：CN102505546A[P].2012-06-20.
[6] 赖勇利，李哲新.发酵过程中菌体浓度的测定[J].发酵科技通讯，2007， 36（4）：48-49.
[7] 余培，朱圣东，雷明科，等.离子液体1乙基3甲基咪唑醋酸盐对酿酒酵母AY93161的毒性及其酒精发酵过程的影响[J].化工学报，2013， 64（11）：4175-4180.
关键词 离子液体〔Emim〕DEP；酿酒酵母SY101；生长影响；EC50
中图分类号S188+.4文献标识码A文章编号0517-6611（2014）29-10299-03
基金项目海南省自然科学基金项目《TiO2/纤维素纳米复合膜材料的制备及其吸附性能研究》（514218）；中国热带农业科学院院本级基本科研业务费专项资金项目（1630062013012）。
作者简介王晓芳（1982- ），女，安徽定远人，助理研究员，硕士，从事食品工程及微生物发酵方面的研究。
离子液体又称低温熔融盐，作为一种新兴的绿色溶剂，其巨大的应用潜力已在整个科学界达成共识[1]。纳米纤维素作为功能材料，其表现出的高比表面积及高强度等优良特性，日益受到各界的广泛关注，蕴藏着无限商机和美好的发展前景。农林废弃物中含有大量优质纤维素[2]，是制备纳米纤维素的丰富原料，且绿色环保[3]。目前从农林废弃物中提取纳米纤维素的方法有化学处理法、酶解法、生物（细菌）制备法、物理法、人工合成法[4]以及离子液体均相制备法，其中用离子液体均相法制备纳米纤维素是一种工艺简单、环境友好的纳米纤维素制备方法[5]。制备纳米纤维素后剩余的残渣中仍然残留大量的纤维素，转换为可还原糖后可被酿酒酵母发酵生产生物乙醇，有效提高农林废弃物综合利用率。但离子液体对酿酒酵母生长繁殖的影响等情况鲜有报道，笔者初步研究了离子液体1乙基3甲基咪唑磷酸二乙酯磷酸盐（〔Emim〕DEP）对酿酒酵母SY101（Saccharomyces cerevisiae SY101）生长的影响，观察了对数生长期〔Emim〕DEP对该菌细胞的形态结构和出芽率的影响，寻找〔Emin〕DEP对酿酒酵母菌的半有效浓度（EC50），旨在为由离子液体从农林废弃物中制备纳米纤维素后的残渣发酵燃料酒精的研究提供基础数据。
1材料与方法
1.1供试菌株与材料试验菌株酿酒酵母SY101（Saccharomyces cerevisiae SY101），由中国热带农业科学院农产品加工研究所实验室保藏；离子液体〔Emin〕DEP由中国热带农业科学院农产品加工研究所实验室制备，纯度达95%；其他试剂为国产分析纯。
1.2试验方法所有试验均重复4次，文中给出的数据为4次试验的平均值，试验相对误差控制在5%以内。
1.2.1菌种培养基的制备。取保存于低温冰箱的酿酒酵母菌株接种于100 ml（装于250 ml锥形瓶）灭菌的液体YPD培养基中，置于恒温振荡培养箱30 ℃、200 r/min活化24 h，活化的菌液稀释6倍后接种于YPD平板培养基中，置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h，挑取单个菌落接种于100 ml锥形瓶（容量为250 ml）液体YPD培养基中，置于振荡恒温箱30 ℃、振幅5 cm、转速为200 r/min培养24 h活化。该菌液用于后续试验中的平板培养、液体悬浮培养的菌种。该试验过程中所用到的培养基的组成：YPD平板培养基，酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂粉20 g/L；YPD液体培养基，酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。上述培养基根据需要，在其中加入适量的离子液体〔Emim〕DEP，121 ℃灭菌20 min。
1.2.2〔Emin〕DEP对酵母菌SY101在平板培养基生长影响的测定。无菌操作下将上述活化后的酵母菌液10倍梯度稀释6次（经多次涂布经验得出稀释6次后的效果较好）。然后吸取200 μl不同浓度的菌液均匀地涂布到含有〔Emim〕DEP浓度分别为0、0.01、0.10、1.00、3.00、5.00、10.00、12.00 g/L的YPD平板培养基，30 ℃恒温培养48 h，观察记录每个平板中的菌落数（CFU）及菌落直径。
1.2.3〔Emin〕DEP对酵母菌SY101在液体培养基生长影响的测定。同“1.2.2”，各取1.0 ml上述活化的酿酒酵母菌液无菌操作加入分别装有不同浓度〔Emin〕DEP的99 ml YPD液体培养基的250 ml锥形瓶中，然后30 ℃、200 r/min的恒温振荡培养24 h。YPD液体培养基中设置〔Emin〕DEP的浓度梯度分别为0、0.01、0.10、1.00、3.00、5.00、10.00、12.00 g/L。培养过程中，间隔一定时间分别取样（前期12 h每隔2 h，后期12 h每隔4 h）。将样品用无菌水稀释10倍后，以未加药物和酵母菌的液体YPD培养基为对照，用722型分光光度计分别测定其在600 nm处的吸光度值（OD600 nm），再以培养时间（h）为横坐标、OD600 nm为纵坐标绘制其24 h的生长曲线[6]。
2结果与分析
2.1离子液体〔Emin〕DEP对酿酒酵母SY101菌落的半效应浓度（EC50）及菌落生长直径的影响半有效浓度（EC50）是毒性研究中的重要指标，可以比较快速地判断被试药物对微生物可能产生的影响，为进一步作慢性毒性研究提供依据。表1给出了不同〔Emin〕DEP的YPD平板培养基上酵母菌SY101培养48 h后的菌落形成单位数（CFU）及平均菌落直径。由表1可知，当〔Emin〕DEP浓度高于12.00 g/L时，该酵母菌的平板上就不再出现生长菌落，且随着〔Emin〕DEP浓度的增加，菌落数在不断减少，单个菌落直径也在不断减小（图1），这也从侧面佐证了〔Emin〕DEP对该酵母菌有抑制作用，当〔Emin〕DEP浓度达到3.00 g/L时，抑制作用趋于明显。通过对表1的数据进行拟合，得到〔Emin〕DEP对该菌的毒力回归方程Y=2.115 6X+0.897 9，R2=0.952 1，得出〔Emin〕DEP对酵母菌SY101的半有效浓度EC50为6.67 g/L（即在平板培养时CFU数为空白对照一半所对应的〔Emin〕DEP浓度）。华中农业大学微生物学国家重点实验室的刘洋洋等于2012年8月份发表的文章称：当离子液体氯化1丁基3甲基咪唑〔Bmim〕Cl浓度为5.000 mg/ml时，酿酒酵母AS2.399在液体YPD培养基中的浓度为对照组的57%[7]；余培等于2013年11月份报道，1乙基3甲基咪唑醋酸盐〔Emin〕AC对酵母菌AY93161的半有效浓度EC50为4.45 g/L[8]。与上述数据进行比较后可得出，〔Emin〕DEP对酵母菌的毒性较温和。 2.2不同离子液体〔Emin〕DEP浓度梯度下的酿酒酵母SY101的生长曲线如图2所示，酵母菌SY101的生长曲线随着〔Emin〕DEP浓度的不同而变化，当〔Emin〕DEP浓度低于5.00 g/L时，酵母菌的生长曲线有着明显的迟滞期、对数期、稳定期和衰退期；当浓度达到及高于10.00 g/L时，曲线变化不明显，浓度达到12.00 g/L时，菌体生长被严重抑制，在培养基中的增幅很小。分析认为，高浓度〔Emin〕DEP抑制了该菌的生长繁殖，从而降低培养液中的菌体浓度，反映在生长曲线上则提前进入稳定期。说明〔Emin〕DEP对酵母菌的生长有抑制作用，且随着浓度的加大，抑制作用逐步加强。
2.3离子液体〔Emin〕DEP对酵母菌SY101形态及出芽率的影响根据绘制出的酵母菌SY101在24 h内的生长曲线图（图2）可以直观地看出，该酵母菌的对数生长期约在培养后的8～10 h，此时的菌体活力最佳。将上述不同浓度梯度〔Emin〕DEP培养液的对数生长期样品于显微镜（粤显牌L3200型）的40倍视野下观察该酵母菌的细胞形态和出芽情况（图3）。
由图3可知，随着〔Emin〕DEP浓度的增加，酵母菌SY101的单细胞形态逐渐由椭圆形变得圆润，出芽率也随之下降。当〔Emin〕DEP 浓度达到3.00 g/L时，酵母菌的单细胞形态明显变圆，说明高浓度〔Emin〕DEP会导致该酵母菌的形态发生变化。在〔Emin〕DEP浓度达到10.00 g/L时，酵母菌的出芽率明显下降，说明高浓度的〔Emin〕DEP会抑制该酵母菌的增殖力。由上所述，分析认为有可能是高浓度的〔Emin〕DEP引起高渗透压，导致该酵母菌新陈代谢紊乱，影响其细胞壁的结构，从而使酵母菌活力下降。图3不同〔Emin〕DEP浓度梯度液体YPD培养基中酿酒酵母SY101的形态和出芽情况3结论
该研究设置了单因素试验，考察了离子液体〔Emin〕DEP对酿酒酵母SY101生长繁殖的影响，主要结论如下： ① 离子液体〔Emin〕DEP浓度低时，不会改变酵母菌单细胞的形态结构和出芽率，浓度增大时会使单细胞形态变得圆润，该酵母菌的出芽率也会随着〔Emin〕DEP浓度升高而降低。② 离子液体〔Emin〕DEP对酿酒酵母SY101的半有效浓度EC50为6.67 g/L。相比较于其他咪唑类离子液体（如〔Emin〕AC对酿酒酵母AY93161的半有效浓度EC50为4.45 g/L），〔Emin〕DEP对该酵母菌的毒性较小，说明〔Emin〕DEP是一种毒性较温和的离子液体，作为溶剂从废弃农作物纤维中提取纳米纤维素后，残留的离子液体（一般浓度会大于10 g/L）会对后续的酒精发酵产生影响，需要经过处理，降低其浓度才能接种酵母进行发酵利用。
参考文献
[1] 刘传富，张爱萍，李维英，等.纤维素在新型绿色溶剂离子液体中的溶解和应用[J].化学进展，2009，21（9）：1800-1806.
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[7] 余培，朱圣东，雷明科，等.离子液体1乙基3甲基咪唑醋酸盐对酿酒酵母AY93161的毒性及其酒精发酵过程的影响[J].化工学报，2013， 64（11）：4175-4180.