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摘 要：脐血作为一种造血干细胞来源可替代骨髓进行造血干细胞移植， 脐血移植在治疗儿童遗传性疾病和血液病方面取得了巨大的成效。为进一步推广脐血移植，必须相应地建立起完备的脐血库。脐血库不同于骨髓库， 它必须冻存实物。为减少冻存体积， 降低成本， 需要采取有效的方法分离脐血中有核细胞， 从而使大规模、广泛地建立脐血库成为可能。本文对脐血造血干细胞分离进行实验研究分析。
引言
脐带血（umbilical cord blood，UCB） 是产后留存在胎盘和脐带中的血液， 以往被作为医学废物而丢弃。近十几年的研究发现，人脐带中存在大量间充质干细胞，间充质干细胞（mesenchymal sterncells，MSCs）是成体干细胞的一种，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能， 可以重建人体造血和免疫系统的造血干/祖细胞， 可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。
一、试验方法
1.1脐带血造血干细胞分离
利用离心沉降法和自然沉降法分离脐带血有核细胞，计算有核细胞回收率和红细胞回收率，比较两种分离方法的分离效果。
离心沉降法：将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1∶5的比例混合，慢速摇匀10min，以50g、10℃离心7min，收集上层富白细胞血浆，再以400g、10℃离心15min，去除血浆。
自然沉降法：将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1：5的比例混合，慢速摇匀10min，悬挂让其内细胞自然沉降1h后，收集上层富白细胞血浆，同样以400g、10℃离心15min，去除血浆。
1.2脐带血造血干细胞冻存
将分离后的脐带血分别与4种不同的冷冻保护剂混合，脐带血与冷冻保护剂的体积比为4∶1，混合时应将冷冻保护剂缓慢注入脐带血中，边注入边晃动。用程控降温仪按以下程序降温，4℃保持10min，以-1℃/min的速率降温至-40℃，再以-10℃/min的速率降温至-80℃，完成后将脐带血混合物放入液氮罐中储存。4种冷冻保护剂分别为：DMSO和0.9%氯化钠溶液1∶1混合液，DMSO和6%右旋糖酐1∶1混合液，DMSO和6%羟乙基淀粉1∶1混合液，DMSO、胎牛血清和F12培养基9∶4∶5混合液。冷冻保护剂新鲜配制并于4℃提前预冷。
1.3冻存后复苏
脐带血冻存3个月后，将冻存的脐带血在37℃水浴锅中复苏，测细胞存活率，用流式细胞仪进行造血干细胞表面标志等分析，并进行祖细胞集落培养，从而比较4种冷冻保护剂的冻存效果的差异性。
1.4存活率检测
取100μL脐带血样品，加入900μL氯化铵溶血素，4℃避光反应5min，200g离心5min，棄上清加入细胞重悬液900μL重悬，再取50μL混合液加入台盼蓝2X溶液50μL，静置3min后计数。每个样品至少数300个细胞，计算有核细胞存活率。
1.5流式细胞仪检测
计数CD34+细胞是检验造血干细胞活性的公认方法之一。取50μL脐带血样品，加入小鼠抗人CD34-PE、CD45-FITC抗体各10μL，室温避光孵育20min，然后加入300μL溶血素避光反应15min，最后加入300μL鞘液避光静置3min，待流式细胞仪检测。
1.6祖细胞集落培养
集落形成分析是一种检验造血干祖细胞活性公认的敏感方法。取100μL脐带血样品，加入900μL氯化铵溶血素，4℃避光反应5min，200g离心5min，弃上清后加入1mLIMDM洗涤2次，加入200μLIMDM重悬，取适量细胞加入甲基纤维素培养基中，培养基中细胞终浓度1×105cells/mL，混匀培养基后平分为2份加入到24孔培养板中，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养12d后分别对CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E进行计数统计。
1.7冻存时间对脐带血造血干细胞的影响
选择上述研究中最佳冷冻保护剂，采用相同的试剂和方法，比较同一份脐带血样本冻存前、冻存3个月、6个月和一年的存活率、有核细胞数、CD34+造血干细胞数、祖细胞集落数。
1.8统计方法
采用SPSS19.0软件进行数据分析，测定结果均按平均值±标准差表示，统计学处理采用区组设计的方差分析，显著性水平为P<0.05。
二、试验结果
2.1有核细胞分离效果
离心沉降法有核细胞回收率为83.60%±9.44%，自然沉降法有核细胞回收率为86.40%±8.49%，二者之间差异无显著性意义（P>0.05），但离心沉降法所需时间更短，操作简便，更适合脐带血库。
2.2复苏后有核细胞回收率和存活率
4种冻存液冻存的细胞复苏后有核细胞回收率和存活率结果见表1。结果表明：第4种冷冻保护剂冻存的细胞复苏后有核细胞回收率与前3种的差异有极显著意义（P<0.01），且数据偏低不能达到要求；第1，2，3种冷冻保护剂复苏有核细胞回收率的差异无显著意义（P>0.05）；4种冷冻保护剂复苏细胞存活率的差异有极显著意义（P<0.01），其中第2种和第3种差异不显著，复苏后存活率最佳。
2.3复苏后流式分析和祖细胞培养
4种冷冻保护剂冻存的细胞复苏流式分析和祖细胞培养结果见表2。4种冷冻保护剂冷冻的细胞复苏CD34+回收率和祖细胞回收率的差异均有极显著意义（P<0.01），其中第2种和第3种差异不显著，流式CD34+和祖细胞回收率最高。
三、结果与讨论
分离脐带血造血干细胞方法常采用分选法、羟乙基淀粉沉淀法和密度梯度离心法。由于目的不同，各类方法有其自身特点。分选法使用磁珠或流式细胞配合相应单克隆抗体分离得到较纯的细胞群体，但细胞回收率较低，且成本昂贵，适合对细胞纯度要求较高的研究； 密度梯度离心法多采用Percoll、Ficoll 分离液分离细胞，得到单个核细胞群，但纯度不高； 羟乙基淀粉沉淀法，分离的细胞量大、成分较多但红细胞含量高，适合脐带血库等用于大量分离储存干细胞。本研究对脐带血库常用的羟乙基淀粉自然沉降法和离心沉降法的有核细胞回收率进行了比较，结果显示两种方法差异无统计学意义，离心沉降法效率更高。
参考文献：
[1]刘献志，刘紫辉，杨波.脐血造血干细胞分离方法的实验研究[J].医药论坛杂志，2007（05）：52-54.
引言
脐带血（umbilical cord blood，UCB） 是产后留存在胎盘和脐带中的血液， 以往被作为医学废物而丢弃。近十几年的研究发现，人脐带中存在大量间充质干细胞，间充质干细胞（mesenchymal sterncells，MSCs）是成体干细胞的一种，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能， 可以重建人体造血和免疫系统的造血干/祖细胞， 可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。
一、试验方法
1.1脐带血造血干细胞分离
利用离心沉降法和自然沉降法分离脐带血有核细胞，计算有核细胞回收率和红细胞回收率，比较两种分离方法的分离效果。
离心沉降法：将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1∶5的比例混合，慢速摇匀10min，以50g、10℃离心7min，收集上层富白细胞血浆，再以400g、10℃离心15min，去除血浆。
自然沉降法：将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1：5的比例混合，慢速摇匀10min，悬挂让其内细胞自然沉降1h后，收集上层富白细胞血浆，同样以400g、10℃离心15min，去除血浆。
1.2脐带血造血干细胞冻存
将分离后的脐带血分别与4种不同的冷冻保护剂混合，脐带血与冷冻保护剂的体积比为4∶1，混合时应将冷冻保护剂缓慢注入脐带血中，边注入边晃动。用程控降温仪按以下程序降温，4℃保持10min，以-1℃/min的速率降温至-40℃，再以-10℃/min的速率降温至-80℃，完成后将脐带血混合物放入液氮罐中储存。4种冷冻保护剂分别为：DMSO和0.9%氯化钠溶液1∶1混合液，DMSO和6%右旋糖酐1∶1混合液，DMSO和6%羟乙基淀粉1∶1混合液，DMSO、胎牛血清和F12培养基9∶4∶5混合液。冷冻保护剂新鲜配制并于4℃提前预冷。
1.3冻存后复苏
脐带血冻存3个月后，将冻存的脐带血在37℃水浴锅中复苏，测细胞存活率，用流式细胞仪进行造血干细胞表面标志等分析，并进行祖细胞集落培养，从而比较4种冷冻保护剂的冻存效果的差异性。
1.4存活率检测
取100μL脐带血样品，加入900μL氯化铵溶血素，4℃避光反应5min，200g离心5min，棄上清加入细胞重悬液900μL重悬，再取50μL混合液加入台盼蓝2X溶液50μL，静置3min后计数。每个样品至少数300个细胞，计算有核细胞存活率。
1.5流式细胞仪检测
计数CD34+细胞是检验造血干细胞活性的公认方法之一。取50μL脐带血样品，加入小鼠抗人CD34-PE、CD45-FITC抗体各10μL，室温避光孵育20min，然后加入300μL溶血素避光反应15min，最后加入300μL鞘液避光静置3min，待流式细胞仪检测。
1.6祖细胞集落培养
集落形成分析是一种检验造血干祖细胞活性公认的敏感方法。取100μL脐带血样品，加入900μL氯化铵溶血素，4℃避光反应5min，200g离心5min，弃上清后加入1mLIMDM洗涤2次，加入200μLIMDM重悬，取适量细胞加入甲基纤维素培养基中，培养基中细胞终浓度1×105cells/mL，混匀培养基后平分为2份加入到24孔培养板中，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养12d后分别对CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E进行计数统计。
1.7冻存时间对脐带血造血干细胞的影响
选择上述研究中最佳冷冻保护剂，采用相同的试剂和方法，比较同一份脐带血样本冻存前、冻存3个月、6个月和一年的存活率、有核细胞数、CD34+造血干细胞数、祖细胞集落数。
1.8统计方法
采用SPSS19.0软件进行数据分析，测定结果均按平均值±标准差表示，统计学处理采用区组设计的方差分析，显著性水平为P<0.05。
二、试验结果
2.1有核细胞分离效果
离心沉降法有核细胞回收率为83.60%±9.44%，自然沉降法有核细胞回收率为86.40%±8.49%，二者之间差异无显著性意义（P>0.05），但离心沉降法所需时间更短，操作简便，更适合脐带血库。
2.2复苏后有核细胞回收率和存活率
4种冻存液冻存的细胞复苏后有核细胞回收率和存活率结果见表1。结果表明：第4种冷冻保护剂冻存的细胞复苏后有核细胞回收率与前3种的差异有极显著意义（P<0.01），且数据偏低不能达到要求；第1，2，3种冷冻保护剂复苏有核细胞回收率的差异无显著意义（P>0.05）；4种冷冻保护剂复苏细胞存活率的差异有极显著意义（P<0.01），其中第2种和第3种差异不显著，复苏后存活率最佳。
2.3复苏后流式分析和祖细胞培养
4种冷冻保护剂冻存的细胞复苏流式分析和祖细胞培养结果见表2。4种冷冻保护剂冷冻的细胞复苏CD34+回收率和祖细胞回收率的差异均有极显著意义（P<0.01），其中第2种和第3种差异不显著，流式CD34+和祖细胞回收率最高。
三、结果与讨论
分离脐带血造血干细胞方法常采用分选法、羟乙基淀粉沉淀法和密度梯度离心法。由于目的不同，各类方法有其自身特点。分选法使用磁珠或流式细胞配合相应单克隆抗体分离得到较纯的细胞群体，但细胞回收率较低，且成本昂贵，适合对细胞纯度要求较高的研究； 密度梯度离心法多采用Percoll、Ficoll 分离液分离细胞，得到单个核细胞群，但纯度不高； 羟乙基淀粉沉淀法，分离的细胞量大、成分较多但红细胞含量高，适合脐带血库等用于大量分离储存干细胞。本研究对脐带血库常用的羟乙基淀粉自然沉降法和离心沉降法的有核细胞回收率进行了比较，结果显示两种方法差异无统计学意义，离心沉降法效率更高。
参考文献：
[1]刘献志，刘紫辉，杨波.脐血造血干细胞分离方法的实验研究[J].医药论坛杂志，2007（05）：52-54.