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[摘 要]本文利用HPLC法测定注射用黄芩苷原料中黄芩苷及有关物质的含量，该方法专属性强，结果准确、可靠，可用于注射用黄芩苷原料中黄芩苷及其有关物质的含量测定。
[关键词]高效液相色谱法；注射用黄芩苷原料；有关物质；含量测定
中图分类号：G45.5 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）25-0391-01
在今天，黄芩苷在我国的临床医疗中应用越来越广泛，但是与其相关的中药制剂有关物质的研究报道却很少，为了能够有效的提高黄芩苷用药的安全性，就需要对相关的黄芩苷原料药的生产和使用进行全面的探究，在探究的过程中，不断的提升其应用的安全性和有效性，从而使得其在临床医学中的应用会越来越广泛。本文就利用HPLC法测定注射用黄芩苷原料中黄芩苷及有关物质的含量进行了简要的探究，具体报道如下。
1、材料
本文研究所采用的仪器主要为分析天平、HPLC仪、泵、脱气机、自动进样器、检测器、柱温箱以及色谱工作站，并对各类仪器的型号进行合理的配置，以保障测定工作可以有效的开展。同时在药品和试剂上要做好相应的选择，所选择的测定药品为注射使用的黄芩苷原料，而其中的对照品需要选用多种，主要包括黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-7-O葡萄醛酸苷，另外选择的色谱纯为甲醇，分析纯为磷酸，同时还需要准备一定量的水，而准备的这些水需要能够对离子具有去除作用。
2、方法
2.1 色谱条件
2.1.1检测波长的选择
需要选用适量的黄芩苷、千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷、汉黄芩苷对照品以及注射使用的黄芩苷原料，采用流动相来对这些物质分别进行溶液的配置，在配置完成后，每种溶液选取一定量，对其进行紫外扫描，注意扫描的波长要控制在200-800nm之间，根据扫描的结果可以看出，各种对照品溶液的波长均在274nm处，并且具有较大的吸收效果，而注射使用的黄芩苷原料溶液的波长处于274nm外其他的位置，而且其在扫描的过程中，并没有出现杂质峰，因此，可以将注射用黄芩苷原料溶液的波长认定在274nm处。除此之外，还需要采用二极管阵列检测器对各种配置的溶液进行详细的检验，以保障溶液检验的合理性，在检验过后，可以得到一个吸收光谱，而从所得的吸收光谱中，可以明显的验证黄芩苷以及其中的各种杂质其波长均在274nm处，具有较强的吸收能力。
2.1.2流动相的选择
就有关的资料显示，在本文的实验中，采用甲醇作为流动相，采用这种溶液作为流动相做研究，由研究的结果可以了解到，黄芩苷与各个成分之间所保留的时间相对来说比较均衡，其中的主要构成成分，相对来说具有较好的峰形，在研究结果中，还可以看出，其中的黄芩苷峰和其他物质的色谱峰均能够有效的满足分离度的实际标准。
2.2 破坏性试验
在进行加速破坏的过程中，需要选用NaOH作为实验溶液加入到注射用黄芩苷原料所配置好的溶液中，注意所选择的NaOH溶液的浓度分别为1mol/L、0.5mol/L，而加入的注射用黄芩苷原料所配置的溶液量为2ml，然后对溶液的变化情况进行观察，可以明显的发现，在NaOH加入之后，黄芩苷马上就出现了分离或者是变性的现象，而且其中的主成分的色谱峰也立刻就消失，使得加速破坏试验的有效性丧失。因此，在进行加速破坏试验的过程中，所选择的添加溶液应该是较为温和的碱性溶液，也就是对相应的NaOH溶液的浓度进行降低处理，最好采用0.05mol/L的NaOH加入到注射用黄芩苷原料所配置的溶液中。
2.3 溶液的制备
2.3.1供试品溶液的制备
称取注射用黄芩苷原料样品约5.0mg，用50%甲醇溶解并定容至50ml量瓶中，作为供试品溶液。
2.3.2对照品溶液的制备
（1）黄芩苷对照品溶液：准确称取黄芩苷对照品适量，加70%甲醇溶解并稀释，制成质量浓度约为100μg/ml的黄芩苷对照品溶液。（2）有关物质混合对照品溶液：准确称取千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷对照品和汉黄芩苷对照品各适量，加70%甲醇溶解并稀释，制成质量浓度分别约为100μg/ml的有关物质混合对照品溶液。
2.3.31%对照溶液的制备
精密量取供试品溶液0.5ml，置50ml量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为1%对照溶液。
2.4 有关物质测定方法
取供试品溶液和对照品溶液各20μl，按上述色谱条件注入HPLC仪，记录色谱图至主成分保留时间的4倍，以供试品溶液色谱图中各杂质峰峰面积、所有杂质峰峰面积总和分别与1%对照溶液中黄芩苷色谱峰的峰面积比较，计算有关物质的质量分数。
2.5 线性关系考察
2.5.1黄芩苷的线性关系考察
分别取黄芩苷对照品溶液5、10、15、20、25、30μl，按上述色谱条件注入HPLC仪测定，记录峰面积。以峰面积积分值（y）对质量浓度（x，μg/ml）进行线性回归，得回归方程为y=34241x-42184（r=0.9999，n=6）。结果表明，黄芩苷的质量浓度在50.00～300.00μg/ml范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。
2.5.2千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷的线性关系考察
取混合对照品溶液适量，用50%甲醇稀释成质量浓度分别为0.21、1.27、2.33、3.39、4.45、5.51、6.57μg/ml的系列溶液，按上述色谱条件各进样10μl，记录峰面积。以峰面积积分值（y）对质量浓度（x，μg/ml）进行线性回归，得回归方程为y=36082x-3390.2（r=0.9993，n=7）。结果表明，千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷的质量浓度在0.21～6.57μg/ml范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。 2.5.3汉黄芩苷的线性关系考察
取混合对照品溶液适量，用50%甲醇稀释成质量浓度分别为0.16、0.32、0.48、0.64、0.80μg/ml的系列溶液，按上述色谱条件各进样10μl，记录峰面积。以峰面积积分值（y）对质量浓度（x，μg/ml）进行线性回归，得回归方程为y=42799x-1049.5（r=0.9993，n=5）。结果表明，汉黄芩苷的质量浓度在0.16～0.80μg/ml范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。
3.结果
黄芩苷、千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷、汉黄芩苷的质量浓度分别在50.00～300.00、0.21～6.57、0.16～0.80μg/ml范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（r分别为0.9999、0.9993、0.9993）；平均加样回收率分别为99.16%、100.69%、99.18%，RSD分别为1.2%、2.4%、4.6%（n均为9）。黄芩苷与有关物质分离良好，千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷与汉黄芩苷的检出限分别为0.43、0.64ng。
4.讨论
样品中汉黄芩苷的质量分数很低，致使本试验中汉黄芩苷重复性、精密度、稳定性及加样回收率试验的RSD>2%，但仍符合微量试验对方法学的要求。与化学原料药相比，注射用黄芩苷原料中同源杂质种类多、含量高，针对这种情况，笔者对其中的部分杂质建立了定量分析法，对提高中药原料及其注射剂的质量标准有一定意义。本试验只对注射用黄芩苷原料有关物质中的A-7-O葡糖醛酸苷和汉黄芩苷进行了指认和含量测定，有关物质中的其他杂质将进一步进行研究分析。
综上，本方法专属性强，灵敏度高，结果准确、可靠，可用于注射用黄芩苷原料中黄芩苷及其有关物质的含量测定。
参考文献
[1] 王丹，蒋亚杰，梁艳，赵琳，蔡少青，尚明英，袁鹏飞，赵玉英，王璇.黄芩不同规格与化学成分及内在质量相关性的研究[J].中国中药杂志.2012（04）.
[2] 黄丽霞，贾晓斌，陈彦，赵呈雷，封亮，蔡垠.HPLC法测定不同产地夏枯草中熊果酸的含量[J].中国药房.2008（12）.
[3] 聂鑫，罗佳波，吕本强，邢学峰.高效液相色谱法定量分析黄芩苷粗品中4种黄酮类成分[J].中国医院药学杂志.2007（02）.
[4] 朱彩燕，沈映冰，廖华卫.HPLC法测定茶多酚缓释胶囊中表没食子儿茶素没食子酸酯的含量[J].中药材.2012（01）.
[关键词]高效液相色谱法；注射用黄芩苷原料；有关物质；含量测定
中图分类号：G45.5 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）25-0391-01
在今天，黄芩苷在我国的临床医疗中应用越来越广泛，但是与其相关的中药制剂有关物质的研究报道却很少，为了能够有效的提高黄芩苷用药的安全性，就需要对相关的黄芩苷原料药的生产和使用进行全面的探究，在探究的过程中，不断的提升其应用的安全性和有效性，从而使得其在临床医学中的应用会越来越广泛。本文就利用HPLC法测定注射用黄芩苷原料中黄芩苷及有关物质的含量进行了简要的探究，具体报道如下。
1、材料
本文研究所采用的仪器主要为分析天平、HPLC仪、泵、脱气机、自动进样器、检测器、柱温箱以及色谱工作站，并对各类仪器的型号进行合理的配置，以保障测定工作可以有效的开展。同时在药品和试剂上要做好相应的选择，所选择的测定药品为注射使用的黄芩苷原料，而其中的对照品需要选用多种，主要包括黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A-7-O葡萄醛酸苷，另外选择的色谱纯为甲醇，分析纯为磷酸，同时还需要准备一定量的水，而准备的这些水需要能够对离子具有去除作用。
2、方法
2.1 色谱条件
2.1.1检测波长的选择
需要选用适量的黄芩苷、千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷、汉黄芩苷对照品以及注射使用的黄芩苷原料，采用流动相来对这些物质分别进行溶液的配置，在配置完成后，每种溶液选取一定量，对其进行紫外扫描，注意扫描的波长要控制在200-800nm之间，根据扫描的结果可以看出，各种对照品溶液的波长均在274nm处，并且具有较大的吸收效果，而注射使用的黄芩苷原料溶液的波长处于274nm外其他的位置，而且其在扫描的过程中，并没有出现杂质峰，因此，可以将注射用黄芩苷原料溶液的波长认定在274nm处。除此之外，还需要采用二极管阵列检测器对各种配置的溶液进行详细的检验，以保障溶液检验的合理性，在检验过后，可以得到一个吸收光谱，而从所得的吸收光谱中，可以明显的验证黄芩苷以及其中的各种杂质其波长均在274nm处，具有较强的吸收能力。
2.1.2流动相的选择
就有关的资料显示，在本文的实验中，采用甲醇作为流动相，采用这种溶液作为流动相做研究，由研究的结果可以了解到，黄芩苷与各个成分之间所保留的时间相对来说比较均衡，其中的主要构成成分，相对来说具有较好的峰形，在研究结果中，还可以看出，其中的黄芩苷峰和其他物质的色谱峰均能够有效的满足分离度的实际标准。
2.2 破坏性试验
在进行加速破坏的过程中，需要选用NaOH作为实验溶液加入到注射用黄芩苷原料所配置好的溶液中，注意所选择的NaOH溶液的浓度分别为1mol/L、0.5mol/L，而加入的注射用黄芩苷原料所配置的溶液量为2ml，然后对溶液的变化情况进行观察，可以明显的发现，在NaOH加入之后，黄芩苷马上就出现了分离或者是变性的现象，而且其中的主成分的色谱峰也立刻就消失，使得加速破坏试验的有效性丧失。因此，在进行加速破坏试验的过程中，所选择的添加溶液应该是较为温和的碱性溶液，也就是对相应的NaOH溶液的浓度进行降低处理，最好采用0.05mol/L的NaOH加入到注射用黄芩苷原料所配置的溶液中。
2.3 溶液的制备
2.3.1供试品溶液的制备
称取注射用黄芩苷原料样品约5.0mg，用50%甲醇溶解并定容至50ml量瓶中，作为供试品溶液。
2.3.2对照品溶液的制备
（1）黄芩苷对照品溶液：准确称取黄芩苷对照品适量，加70%甲醇溶解并稀释，制成质量浓度约为100μg/ml的黄芩苷对照品溶液。（2）有关物质混合对照品溶液：准确称取千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷对照品和汉黄芩苷对照品各适量，加70%甲醇溶解并稀释，制成质量浓度分别约为100μg/ml的有关物质混合对照品溶液。
2.3.31%对照溶液的制备
精密量取供试品溶液0.5ml，置50ml量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为1%对照溶液。
2.4 有关物质测定方法
取供试品溶液和对照品溶液各20μl，按上述色谱条件注入HPLC仪，记录色谱图至主成分保留时间的4倍，以供试品溶液色谱图中各杂质峰峰面积、所有杂质峰峰面积总和分别与1%对照溶液中黄芩苷色谱峰的峰面积比较，计算有关物质的质量分数。
2.5 线性关系考察
2.5.1黄芩苷的线性关系考察
分别取黄芩苷对照品溶液5、10、15、20、25、30μl，按上述色谱条件注入HPLC仪测定，记录峰面积。以峰面积积分值（y）对质量浓度（x，μg/ml）进行线性回归，得回归方程为y=34241x-42184（r=0.9999，n=6）。结果表明，黄芩苷的质量浓度在50.00～300.00μg/ml范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。
2.5.2千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷的线性关系考察
取混合对照品溶液适量，用50%甲醇稀释成质量浓度分别为0.21、1.27、2.33、3.39、4.45、5.51、6.57μg/ml的系列溶液，按上述色谱条件各进样10μl，记录峰面积。以峰面积积分值（y）对质量浓度（x，μg/ml）进行线性回归，得回归方程为y=36082x-3390.2（r=0.9993，n=7）。结果表明，千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷的质量浓度在0.21～6.57μg/ml范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。 2.5.3汉黄芩苷的线性关系考察
取混合对照品溶液适量，用50%甲醇稀释成质量浓度分别为0.16、0.32、0.48、0.64、0.80μg/ml的系列溶液，按上述色谱条件各进样10μl，记录峰面积。以峰面积积分值（y）对质量浓度（x，μg/ml）进行线性回归，得回归方程为y=42799x-1049.5（r=0.9993，n=5）。结果表明，汉黄芩苷的质量浓度在0.16～0.80μg/ml范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。
3.结果
黄芩苷、千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷、汉黄芩苷的质量浓度分别在50.00～300.00、0.21～6.57、0.16～0.80μg/ml范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（r分别为0.9999、0.9993、0.9993）；平均加样回收率分别为99.16%、100.69%、99.18%，RSD分别为1.2%、2.4%、4.6%（n均为9）。黄芩苷与有关物质分离良好，千层纸素A-7-O葡糖醛酸苷与汉黄芩苷的检出限分别为0.43、0.64ng。
4.讨论
样品中汉黄芩苷的质量分数很低，致使本试验中汉黄芩苷重复性、精密度、稳定性及加样回收率试验的RSD>2%，但仍符合微量试验对方法学的要求。与化学原料药相比，注射用黄芩苷原料中同源杂质种类多、含量高，针对这种情况，笔者对其中的部分杂质建立了定量分析法，对提高中药原料及其注射剂的质量标准有一定意义。本试验只对注射用黄芩苷原料有关物质中的A-7-O葡糖醛酸苷和汉黄芩苷进行了指认和含量测定，有关物质中的其他杂质将进一步进行研究分析。
综上，本方法专属性强，灵敏度高，结果准确、可靠，可用于注射用黄芩苷原料中黄芩苷及其有关物质的含量测定。
参考文献
[1] 王丹，蒋亚杰，梁艳，赵琳，蔡少青，尚明英，袁鹏飞，赵玉英，王璇.黄芩不同规格与化学成分及内在质量相关性的研究[J].中国中药杂志.2012（04）.
[2] 黄丽霞，贾晓斌，陈彦，赵呈雷，封亮，蔡垠.HPLC法测定不同产地夏枯草中熊果酸的含量[J].中国药房.2008（12）.
[3] 聂鑫，罗佳波，吕本强，邢学峰.高效液相色谱法定量分析黄芩苷粗品中4种黄酮类成分[J].中国医院药学杂志.2007（02）.
[4] 朱彩燕，沈映冰，廖华卫.HPLC法测定茶多酚缓释胶囊中表没食子儿茶素没食子酸酯的含量[J].中药材.2012（01）.