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摘 要： 以农作物秸秆，包括水稻秸秆、玉米秸秆和甘蔗渣为材料，采用分光光度法比较了烟曲霉、绿色木霉、枯草芽孢杆菌的处理效果.实验结果显示：总乙醇产量最高的是甘蔗渣，其乙醇体积分数为6.285%;而玉米秸稈和水稻秸秆相差甚微，分别是6.200%和6.195%.用2% （体积分数）氢氧化钠溶液预处理甘蔗渣，再用烟曲霉在28 ℃下降解甘蔗渣，最后用缺陷型酵母发酵预处理滤液和烟曲霉降解液20～25 h，可以提高木质纤维素降解、转化乙醇的效率.
关键词： 秸秆; 纤维素; 乙醇; 降解; 效率
Abstract： In this study， stems of crops， including straw of rice， stalk of corn and bagasse， were used as fermentation materials. The hydrolysis treatment effects of Aspergillus fumigatus， Trichoderma viride and Bacillus subtilis were compared via spectrophotometry. The results showed that the highest yield of ethanol was from bagasse with eventually volume fraction of ethanol in total was 6.285% volume fraction. The difference of yields between corn straw and rice straw was slightly， which were 6.200% and 6.195% respectively. Using 2% NaOH pretreating sugarcane bagasse， then using Aspergillus fumigatus to degradeat 28 ℃， 20-25 h fermentation of pretreated filtrate with defective yeast and Aspergillus fumigatus degradation solution， it can improve the degradation efficiency of the lignocellulose conversion.
Key words： straw; cellulose; ethanol; degradation; efficiency
0 引 言
随着全球经济的持续高速发展，人们对能源的需求加速增长，也同时加重了环境污染[1].近年来，以从农作物秸秆中得到的木质纤维素为原料，生产乙醇的研究日益受到重视[2-3].虽然木质纤维素往往具有分布分散、能量密度小、热值低和成分复杂等缺点，但在可再生能源中，木质纤维素制备的燃料乙醇具有方便储存与运输的优点，在世界各国都得到充分重视和应用发展[4-5].因此，开展对提高木质纤维素降解转化效率的研究具有重要的现实意义.
木质纤维素主要由纤维素（40%～50%，质量分数）、半纤维素（25%～35%，质量分数）和木质素（15%～20%，质量分数）构成[6-7].目前利用木质纤维素生产乙醇的技术已基本成熟.经预处理[8-9]后，木质纤维素原料生产乙醇的过程可以分为两步：第一步把纤维素水解为葡萄糖等可发酵的糖，即糖化过程[10-11];第二步将发酵液发酵为乙醇[12].
由于木质素、半纤维素对纤维素的保护作用，以及纤维素自身的晶体结构， 使得催化剂很难与纤维素接触，必须对纤维素原料进行预处理，以除脱木质素，避免多糖的降解和损失，以及产生副产品，同时降低成本[13].水解主要有两种方法，即酸水解[14]和酶水解，木质纤维原料的酶水解是利用纤维素酶、半纤维素酶将纤维素、半纤维素转化为可被利用的葡萄糖和戊糖[15-16].发酵过程是木质纤维原料中的纤维素先经纤维素酶降解成葡萄糖，葡萄糖再经发酵菌株发酵生成乙醇[17-19].如何优化木质纤维素预处理，选择合适的发酵菌种，降低成本，提高发酵效率及乙醇的获取率，是目前的研究难点[20-21].根据本实验室前期的数据，本文作者选用质量分数为2%的氢氧化钠（NaOH）溶液对3种木质纤维素进行预处理[22]，并结合专一性强且无污染酶水解法进行转化.通过比较，发现选择烟曲霉作为发酵菌种可降低生产成本，提高转化效率.
1 材料与方法
1.1 材 料
实验所用的水稻秸秆、玉米秸秆、甘蔗渣均取自南宁普建糖酒化工设备有限公司;实验所用化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司和上海生工生物工程股份有限公司;烟曲霉、绿色木霉枯草芽孢杆菌和缺陷型酵母为上海大学微生物实验室保存，均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心;所使用的Czapek’s Agar察氏琼脂培养基、Potato Dextrose Agar （PDA）培养基、Luria-Bertani （LB）培养基、Yeast Extract Peptone Adenine Sulfate （YPDA）培养基均由实验室自配.
1.2 方 法
1.2.1 DNS（3，5-二硝基水杨酸）分光光度法测定葡萄糖[23]
用分光光度法测量各滤液中的葡萄糖含量，方法为：取0.1 g葡萄糖溶于100 mL水，配制成质量浓度为1 mg?mL-1的葡萄糖标准溶液;取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水，溶解后移入1 000 mL容量瓶，加入325 mL物质的量浓度为2 mol?L-1的NaOH和5 g丙三醇，摇匀，冷却定容至1 000 mL. 10 h后取出滤渣称重. 1.2.2 原子力显微镜（AFM）视图
用原子力显微镜（安捷伦AFM5500）分别观察未处理、预处理后，和仅有烟曲菌处理的甘蔗渣形貌.
1.2.3 不同木质纤维素的碱法预处理
取4 g NaOH固体溶解于蒸馏水中定容至200 mL（共6份），配制成质量分数为2%的NaOH溶液.将准备的10 g水稻秸秆（编号A组，共两份：A1，A2），10 g玉米秸秆（编号B组，共两份：B1，B2），10 g甘蔗渣（编号C组，共两份：C1，C2）分别加入200 mL的上述NaOH溶液中，室温条件下摇24 h后，用纱布分别过滤6份混合液，得到6份滤渣，放入80 ℃烘箱10 h，得到6份滤液，用量筒测量滤液体积.制作DNS标准曲线，采用分光光度法测量各滤液中的葡萄糖含量.
1.2.4 对碱法预处理后的木质纤维素开展不同菌种的降解处理
取10 g水稻秸秆于6个锥形瓶中，编号1～6.分别加入200 mL质量分数为2%的NaOH溶液，略微振荡，放入37 ℃摇床中，放置24 h后取出過滤，滤渣80 ℃烘箱烘干，收集滤液.刮取全部滤渣并测定其干重.冷冻菌种的活化（绿色木霉、烟曲霉）后对应接种在PDA平板和察氏琼脂平板上，28 ℃下培养.将枯草芽孢杆菌接种在LB平板上，37℃下培养.接种缺陷型酵母菌于3块YPDA平板，放恒温箱中，24 h后分别向培养基中倒入一次扩大过的3种菌液，摇床24 h.从恒温箱中取出活化好的酵母菌，分别接种到12支YPDA试管中，摇床24 h.将12瓶待发酵液过滤，滤渣烘干，所有待发酵液以4 000 r?min-1转速离心10 min.用分光光度法测量12瓶待发酵液中葡萄糖的含量.调控12瓶待发酵液的pH值为7.每瓶取40 mL的液体，分别与4 mL的YPDA培养基混合（共12瓶），放入摇床中，在37 ℃和200 r?min-1转速条件下，每隔4 h定时取样.
1.2.5 烟曲霉处理不同木质纤维素
分别取10 g水稻秸秆、玉米秸、甘蔗渣置于6个锥形瓶中，编号1～6.各加入200 mL质量分数为2%的NaOH溶液，略微振荡，放入37 ℃摇床中，放置24 h后过滤，得到的滤渣80 ℃烘干，收集滤液.从察氏琼脂液体培养基上挑少量烟曲霉，放入试管液体培养基内，轻轻振荡.在28 ℃摇床放置24 h后，接种在察氏琼脂平板上，28 ℃下培养.24 h后将烟曲霉接种到察氏琼脂培养基试管中，放入摇床24 h.接种缺陷型酵母菌于3块YPDA平板，在恒温箱中放置24 h后，向200 mL察氏琼脂培养基中倒入一次扩大过的菌液，摇床24 h.从恒温箱中取出活化好的酵母菌，分别接种到12支YPDA试管中（4 mL菌种培养液放入40 mL待发酵液中），摇床24 h.将12瓶待发酵液过滤（6瓶碱处理，6瓶菌处理），滤渣烘干24 h.所有待发酵液以4 000 r?min-1离心10 min.用分光光度法测量12瓶待发酵液中葡萄糖的含量.调控12瓶待发酵液的pH值为7，每瓶取40 mL的液体，分别与4 mL的YPDA培养基混合（共12瓶），放入摇床，在37 ℃和200 r?min-1转速条件下，每隔4 h定时取样.
2 结果与分析
2.1 3种木质纤维素相同碱预处理结果比较
用2%NaOH溶液碱预处理秸秆，用DNS分光光度法（标准曲线公式y=0.737 6x-0.086 8）计算反应体系中葡萄糖含量，结果如图1所示.
由图1可知：经2%NaOH溶液碱预处理后，水稻秸秆的木质纤维素成分被降解的程度最高，玉米秸秆次之，甘蔗渣被降解程度最低.在相同碱预处理前提下，应选用水稻秸秆作为后续发酵工艺的材料.
2.2 不同菌种降解预处理结果比较
10 g水稻秸秆先经过2%NaOH处理，再经过不同菌处理，得到待测液中的葡萄糖含量，如图2所示.
由图2可知：烟曲霉组的水稻秸秆在两次处理后共产葡萄糖936.10 mg;绿色木霉组两次处理后共产葡萄糖884.18 mg;枯草芽孢杆菌两次处理后共产葡萄糖388.63 mg.因此，烟曲霉是菌处理的最佳选择.
将绿色木霉和烟曲霉做进一步比较，烟曲霉发酵效果比绿色木霉好（图3），理想发酵时间大约是20～25 h.同时碱处理理想发酵时间也为20～25 h（图4）.
2.3 原子力显微镜观察不同处理下的甘蔗渣
通过AFM图能更直观地观察几种处理方法的差别.未处理的甘蔗渣形貌图中有大块较规律排布的白色区域，它们是比较完整的纤维结构，如图5（a）所示.用2%NaOH处理过的甘蔗渣纤维结构不够清晰，整个结构松散模糊，代表碱溶液已经基本将整个纤维结构打散，将木质素有效地分离，并开始分解纤维素，如图5（b）所示.而仅用烟曲霉处理的甘蔗渣有一部分为比较清晰的纤维状物质，但周围出现比较松散模糊的结构，说明烟曲霉虽分解了一部分纤维素，但还有不少纤维被木质素包裹，不能利用，如图5（c）所示.
2.4 烟曲霉处理不同木质纤维素结果比较
取水稻秸秆、玉米秸秆、甘蔗秸秆各10 g，经2% NaOH处理后，再经烟曲霉降解处理、发酵.因为经碱处理过后的滤液发酵效果大体一致，所以主要比较3种木质纤维素经过烟曲霉降解后的乙醇产量，如图6所示，可知甘蔗渣发酵效果最好.
由实验结果可知，最优发酵处理组合为：先用2%NaOH溶液对甘蔗进行处理，有效地剥离木质素，释放出纤维素;再用烟曲霉对滤渣进行处理，将多糖有效地降解为单糖，在最适pH值为7的条件下用腺嘌呤缺陷型酵母菌对其进行发酵20～25 h.但即便如此，得到的乙醇体积分数仍不足7%，其原因主要是木质纤维素甘蔗渣还未被充分降解.一方面，由于烟曲霉是新引进的发酵菌种，对其培养和扩大所需的条件还未有深入研究，所培养的菌株还未处于最高的活性状态;另一方面，在发酵过程中取样时，乙醇容易挥发，这会直接导致乙醇产量不稳定和产量过低. 3 结 论
本文初步研究了木质纤维素降解转化乙醇的处理方法组合，先用质量分数为2%的NaOH溶液对甘蔗渣进行预处理，能有效地剥离木质素，释放出纤维素;再用烟曲霉对滤渣进行进一步处理，将多糖有效地降解为单糖，在pH值为7的最适条件下，用腺嘌呤缺陷型酵母菌将其发酵20～25 h.实验结果表明：该处理组合可有效降低生产成本，提高转化效率.
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（责任编辑：顾浩然）
关键词： 秸秆; 纤维素; 乙醇; 降解; 效率
Abstract： In this study， stems of crops， including straw of rice， stalk of corn and bagasse， were used as fermentation materials. The hydrolysis treatment effects of Aspergillus fumigatus， Trichoderma viride and Bacillus subtilis were compared via spectrophotometry. The results showed that the highest yield of ethanol was from bagasse with eventually volume fraction of ethanol in total was 6.285% volume fraction. The difference of yields between corn straw and rice straw was slightly， which were 6.200% and 6.195% respectively. Using 2% NaOH pretreating sugarcane bagasse， then using Aspergillus fumigatus to degradeat 28 ℃， 20-25 h fermentation of pretreated filtrate with defective yeast and Aspergillus fumigatus degradation solution， it can improve the degradation efficiency of the lignocellulose conversion.
Key words： straw; cellulose; ethanol; degradation; efficiency
0 引 言
随着全球经济的持续高速发展，人们对能源的需求加速增长，也同时加重了环境污染[1].近年来，以从农作物秸秆中得到的木质纤维素为原料，生产乙醇的研究日益受到重视[2-3].虽然木质纤维素往往具有分布分散、能量密度小、热值低和成分复杂等缺点，但在可再生能源中，木质纤维素制备的燃料乙醇具有方便储存与运输的优点，在世界各国都得到充分重视和应用发展[4-5].因此，开展对提高木质纤维素降解转化效率的研究具有重要的现实意义.
木质纤维素主要由纤维素（40%～50%，质量分数）、半纤维素（25%～35%，质量分数）和木质素（15%～20%，质量分数）构成[6-7].目前利用木质纤维素生产乙醇的技术已基本成熟.经预处理[8-9]后，木质纤维素原料生产乙醇的过程可以分为两步：第一步把纤维素水解为葡萄糖等可发酵的糖，即糖化过程[10-11];第二步将发酵液发酵为乙醇[12].
由于木质素、半纤维素对纤维素的保护作用，以及纤维素自身的晶体结构， 使得催化剂很难与纤维素接触，必须对纤维素原料进行预处理，以除脱木质素，避免多糖的降解和损失，以及产生副产品，同时降低成本[13].水解主要有两种方法，即酸水解[14]和酶水解，木质纤维原料的酶水解是利用纤维素酶、半纤维素酶将纤维素、半纤维素转化为可被利用的葡萄糖和戊糖[15-16].发酵过程是木质纤维原料中的纤维素先经纤维素酶降解成葡萄糖，葡萄糖再经发酵菌株发酵生成乙醇[17-19].如何优化木质纤维素预处理，选择合适的发酵菌种，降低成本，提高发酵效率及乙醇的获取率，是目前的研究难点[20-21].根据本实验室前期的数据，本文作者选用质量分数为2%的氢氧化钠（NaOH）溶液对3种木质纤维素进行预处理[22]，并结合专一性强且无污染酶水解法进行转化.通过比较，发现选择烟曲霉作为发酵菌种可降低生产成本，提高转化效率.
1 材料与方法
1.1 材 料
实验所用的水稻秸秆、玉米秸秆、甘蔗渣均取自南宁普建糖酒化工设备有限公司;实验所用化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司和上海生工生物工程股份有限公司;烟曲霉、绿色木霉枯草芽孢杆菌和缺陷型酵母为上海大学微生物实验室保存，均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心;所使用的Czapek’s Agar察氏琼脂培养基、Potato Dextrose Agar （PDA）培养基、Luria-Bertani （LB）培养基、Yeast Extract Peptone Adenine Sulfate （YPDA）培养基均由实验室自配.
1.2 方 法
1.2.1 DNS（3，5-二硝基水杨酸）分光光度法测定葡萄糖[23]
用分光光度法测量各滤液中的葡萄糖含量，方法为：取0.1 g葡萄糖溶于100 mL水，配制成质量浓度为1 mg?mL-1的葡萄糖标准溶液;取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水，溶解后移入1 000 mL容量瓶，加入325 mL物质的量浓度为2 mol?L-1的NaOH和5 g丙三醇，摇匀，冷却定容至1 000 mL. 10 h后取出滤渣称重. 1.2.2 原子力显微镜（AFM）视图
用原子力显微镜（安捷伦AFM5500）分别观察未处理、预处理后，和仅有烟曲菌处理的甘蔗渣形貌.
1.2.3 不同木质纤维素的碱法预处理
取4 g NaOH固体溶解于蒸馏水中定容至200 mL（共6份），配制成质量分数为2%的NaOH溶液.将准备的10 g水稻秸秆（编号A组，共两份：A1，A2），10 g玉米秸秆（编号B组，共两份：B1，B2），10 g甘蔗渣（编号C组，共两份：C1，C2）分别加入200 mL的上述NaOH溶液中，室温条件下摇24 h后，用纱布分别过滤6份混合液，得到6份滤渣，放入80 ℃烘箱10 h，得到6份滤液，用量筒测量滤液体积.制作DNS标准曲线，采用分光光度法测量各滤液中的葡萄糖含量.
1.2.4 对碱法预处理后的木质纤维素开展不同菌种的降解处理
取10 g水稻秸秆于6个锥形瓶中，编号1～6.分别加入200 mL质量分数为2%的NaOH溶液，略微振荡，放入37 ℃摇床中，放置24 h后取出過滤，滤渣80 ℃烘箱烘干，收集滤液.刮取全部滤渣并测定其干重.冷冻菌种的活化（绿色木霉、烟曲霉）后对应接种在PDA平板和察氏琼脂平板上，28 ℃下培养.将枯草芽孢杆菌接种在LB平板上，37℃下培养.接种缺陷型酵母菌于3块YPDA平板，放恒温箱中，24 h后分别向培养基中倒入一次扩大过的3种菌液，摇床24 h.从恒温箱中取出活化好的酵母菌，分别接种到12支YPDA试管中，摇床24 h.将12瓶待发酵液过滤，滤渣烘干，所有待发酵液以4 000 r?min-1转速离心10 min.用分光光度法测量12瓶待发酵液中葡萄糖的含量.调控12瓶待发酵液的pH值为7.每瓶取40 mL的液体，分别与4 mL的YPDA培养基混合（共12瓶），放入摇床中，在37 ℃和200 r?min-1转速条件下，每隔4 h定时取样.
1.2.5 烟曲霉处理不同木质纤维素
分别取10 g水稻秸秆、玉米秸、甘蔗渣置于6个锥形瓶中，编号1～6.各加入200 mL质量分数为2%的NaOH溶液，略微振荡，放入37 ℃摇床中，放置24 h后过滤，得到的滤渣80 ℃烘干，收集滤液.从察氏琼脂液体培养基上挑少量烟曲霉，放入试管液体培养基内，轻轻振荡.在28 ℃摇床放置24 h后，接种在察氏琼脂平板上，28 ℃下培养.24 h后将烟曲霉接种到察氏琼脂培养基试管中，放入摇床24 h.接种缺陷型酵母菌于3块YPDA平板，在恒温箱中放置24 h后，向200 mL察氏琼脂培养基中倒入一次扩大过的菌液，摇床24 h.从恒温箱中取出活化好的酵母菌，分别接种到12支YPDA试管中（4 mL菌种培养液放入40 mL待发酵液中），摇床24 h.将12瓶待发酵液过滤（6瓶碱处理，6瓶菌处理），滤渣烘干24 h.所有待发酵液以4 000 r?min-1离心10 min.用分光光度法测量12瓶待发酵液中葡萄糖的含量.调控12瓶待发酵液的pH值为7，每瓶取40 mL的液体，分别与4 mL的YPDA培养基混合（共12瓶），放入摇床，在37 ℃和200 r?min-1转速条件下，每隔4 h定时取样.
2 结果与分析
2.1 3种木质纤维素相同碱预处理结果比较
用2%NaOH溶液碱预处理秸秆，用DNS分光光度法（标准曲线公式y=0.737 6x-0.086 8）计算反应体系中葡萄糖含量，结果如图1所示.
由图1可知：经2%NaOH溶液碱预处理后，水稻秸秆的木质纤维素成分被降解的程度最高，玉米秸秆次之，甘蔗渣被降解程度最低.在相同碱预处理前提下，应选用水稻秸秆作为后续发酵工艺的材料.
2.2 不同菌种降解预处理结果比较
10 g水稻秸秆先经过2%NaOH处理，再经过不同菌处理，得到待测液中的葡萄糖含量，如图2所示.
由图2可知：烟曲霉组的水稻秸秆在两次处理后共产葡萄糖936.10 mg;绿色木霉组两次处理后共产葡萄糖884.18 mg;枯草芽孢杆菌两次处理后共产葡萄糖388.63 mg.因此，烟曲霉是菌处理的最佳选择.
将绿色木霉和烟曲霉做进一步比较，烟曲霉发酵效果比绿色木霉好（图3），理想发酵时间大约是20～25 h.同时碱处理理想发酵时间也为20～25 h（图4）.
2.3 原子力显微镜观察不同处理下的甘蔗渣
通过AFM图能更直观地观察几种处理方法的差别.未处理的甘蔗渣形貌图中有大块较规律排布的白色区域，它们是比较完整的纤维结构，如图5（a）所示.用2%NaOH处理过的甘蔗渣纤维结构不够清晰，整个结构松散模糊，代表碱溶液已经基本将整个纤维结构打散，将木质素有效地分离，并开始分解纤维素，如图5（b）所示.而仅用烟曲霉处理的甘蔗渣有一部分为比较清晰的纤维状物质，但周围出现比较松散模糊的结构，说明烟曲霉虽分解了一部分纤维素，但还有不少纤维被木质素包裹，不能利用，如图5（c）所示.
2.4 烟曲霉处理不同木质纤维素结果比较
取水稻秸秆、玉米秸秆、甘蔗秸秆各10 g，经2% NaOH处理后，再经烟曲霉降解处理、发酵.因为经碱处理过后的滤液发酵效果大体一致，所以主要比较3种木质纤维素经过烟曲霉降解后的乙醇产量，如图6所示，可知甘蔗渣发酵效果最好.
由实验结果可知，最优发酵处理组合为：先用2%NaOH溶液对甘蔗进行处理，有效地剥离木质素，释放出纤维素;再用烟曲霉对滤渣进行处理，将多糖有效地降解为单糖，在最适pH值为7的条件下用腺嘌呤缺陷型酵母菌对其进行发酵20～25 h.但即便如此，得到的乙醇体积分数仍不足7%，其原因主要是木质纤维素甘蔗渣还未被充分降解.一方面，由于烟曲霉是新引进的发酵菌种，对其培养和扩大所需的条件还未有深入研究，所培养的菌株还未处于最高的活性状态;另一方面，在发酵过程中取样时，乙醇容易挥发，这会直接导致乙醇产量不稳定和产量过低. 3 结 论
本文初步研究了木质纤维素降解转化乙醇的处理方法组合，先用质量分数为2%的NaOH溶液对甘蔗渣进行预处理，能有效地剥离木质素，释放出纤维素;再用烟曲霉对滤渣进行进一步处理，将多糖有效地降解为单糖，在pH值为7的最适条件下，用腺嘌呤缺陷型酵母菌将其发酵20～25 h.实验结果表明：该处理组合可有效降低生产成本，提高转化效率.
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（责任编辑：顾浩然）