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【摘要】目的：建立茯苓酸的含量测定方法。方法：反相高效液相色谱法、保留时间定性和外标两点法定量。结果：茯苓酸的最佳提取方法为为把茯苓粉末过60目筛后用甲醇超声提取1小时。结论：该提取方法稳定可行，适用于茯苓酸的提取。
茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos （Schw.） Wolf的干燥菌核。其味甘、淡、平、归肺、胃、肾经。具有利水渗湿，健脾宁心的功效。用于水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠[1]。茯苓酸为四环三萜酸，是茯苓中的主要活性成分之一[2～3]，具有增强人体免疫力、抗癌、增强胰岛素的分化诱导及止吐等作用。本文采用高效液相色谱法，建立其含量测定方法，为茯苓的质量评价提供依据。
1、仪器与材料
1.1仪器与试药
1.1.1仪器 LC200高效液相色谱仪（美国PE）；PL-203电子天平（瑞士）；HUMANpowerl（Scholar） 纯水/超纯水系统（韩国）；SK-18TC超声波清洗器。
1.1.2试剂 试剂乙腈为色谱，纯水为自制高纯水，其他试剂均为AR。茯苓酸对照品。
2、高效液相色谱条件的选择
用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂（DiamonsilC18，4.6×250nm，5um）；柱温25℃；乙腈-0.4%乙酸（85：15）为流动相；流速1mLmin-1；206nm检测。此条件下，茯苓酸和样品中的其它物质可以达到良好的分离。
3、方法与结果
3.1对照品溶液制备
精密称取茯苓酸对照品4.9mg，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，摇匀。即配制得0.49mg/mL的茯苓酸对照品溶液。
3.2标准曲线的制备
在上述色谱条件下分别精密吸取对照品溶液（0.49mg/mL）2ul、4ul、6ul、8ul、10ul注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为横坐标茯苓酸进样质量为纵坐标，绘制标准曲线。茯苓酸质量在0.49ug-5.88ug范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为：Y=2.059×10-6X-0.121146，相关系数r=0.9997。
3.3提取条件的考察[4～6]
3.3.1提取溶剂的考察
取茯苓药材粉末（60目）约2g共5份，精密称定，分别加入甲醇、无水乙醇、乙醚、氯仿、丙酮20mL，超声提取30min（中途补充损失的溶剂），取出，放冷，过滤；用微孔滤膜（0.45ul）滤过，各进样20ul进行液相色谱分析。不同溶剂对测定结果的影响结果见表1-1。
表1-1 提取溶剂对测定结果的影响（n=3）
溶剂 甲醇 无水乙醇 乙醚 氯仿 丙酮
茯苓酸含量（%） 0.0625 0.0562 0.0525 0.0447 0.0395
以上结果表明，甲醇作为提取溶剂，得到的茯苓酸的含量最高，故选择甲醇作为供试品溶液制备的的提取溶剂。
3.3.2提取方法的考察
取茯苓药材粉末（60目）约2g，精密称定，置100mL三角瓶中，共3 份，分别加入20mL甲醇，称定重量，采用超声45min、热回流3h、冷浸24h的提取方法；取出，放冷，用甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过。取续滤液用微孔滤膜（0.45ul）滤过，各进样20ul进行液相色谱分析。结果表明，超声法提取含量最高，故选择超声处理法作为供试品溶液制备的提取方法。
3.3.3提取时间的考察
取茯苓药材粉末（过60目筛）约2g，精密称定，置100mL三角瓶中，共6份，分别加入20mL甲醇，称定重量，超声提取15min、30min、45min、60min、90min、120min，取出，放冷，用甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过。取续滤液用微孔滤膜（0.45ul）滤过，各进样20ul进行液相色谱分析。对提取时间进行考察结果见表1-2。
表1-2 提取时间对测定结果的影响（n=3）
时间（min） 15 30 45 60 90 120
茯苓酸含量（%） 0.0561 0.0579 0.0596 0.0619 0.0637 0.0612
以上结果表明，超声处理90分钟提取含量最高，故确定提取时间为90分钟，供试品溶液采用超声处理90分钟。
3.3.4粉碎粒度的选择
分别取茯苓药材粉末20目、40目、60目、80目约2g，精密称定，置100mL三角瓶中，加入20mL甲醇，称定重量，超声提取90分钟，取出，放冷，用甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过。取续滤液用微孔滤膜（0.45ul）滤过，各进样20ul进行液相色谱分析。结果表明，药材粉碎粒度为60目时，提取的茯苓酸含量最高，故确定药材粉碎过60目筛。
4、讨论
本研究筛选出茯苓酸提取条件为把茯苓粉末过60目筛后用甲醇超声提取1小时。该提取方法稳定可行。超声提取方法简便，提取率高，比常规提取方法的操作时间缩短10一20倍。超声提取天然药物有效成分具有周期短、成本低、不破坏活性成分等显著优点，用于茯苓酸的提取可以节约成本，提高效率。
参考文献
[1]国家药典委员会.《中华人民其和国药》2010年版（一部）[M].化学工业出版社，2010：224.
[2]仲兆金，刘浚.茯苓有效成分三萜的研究进展[J].中成药，2001，23（1）：58—62.
[3]张思访，刘静涵，蒋建勤等.茯苓的化学成分和药理作用及开发利用Ⅲ[J].中华实用中西医杂志，2005，18（2）：277—230.
[4]赵英博，徐斌，昝俊峰等.不同产地茯苓中茯苓酸含量的比较研究[J].中国中医药信息杂志，2009，16（7）：41—42.
[5]易中宏.茯苓药材质量标准研究[D].重庆大学，2005
[6]段启，姚丽梅，庄仪修.茯苓与茯苓皮中茯苓酸的含量比较[J].中药新药与临床药理，2010，21（6）：654—659.
作者简介
马巾媛，（1981～）女，硕士，助教，主要从事中草药鉴定方面的研究。
茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos （Schw.） Wolf的干燥菌核。其味甘、淡、平、归肺、胃、肾经。具有利水渗湿，健脾宁心的功效。用于水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠[1]。茯苓酸为四环三萜酸，是茯苓中的主要活性成分之一[2～3]，具有增强人体免疫力、抗癌、增强胰岛素的分化诱导及止吐等作用。本文采用高效液相色谱法，建立其含量测定方法，为茯苓的质量评价提供依据。
1、仪器与材料
1.1仪器与试药
1.1.1仪器 LC200高效液相色谱仪（美国PE）；PL-203电子天平（瑞士）；HUMANpowerl（Scholar） 纯水/超纯水系统（韩国）；SK-18TC超声波清洗器。
1.1.2试剂 试剂乙腈为色谱，纯水为自制高纯水，其他试剂均为AR。茯苓酸对照品。
2、高效液相色谱条件的选择
用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂（DiamonsilC18，4.6×250nm，5um）；柱温25℃；乙腈-0.4%乙酸（85：15）为流动相；流速1mLmin-1；206nm检测。此条件下，茯苓酸和样品中的其它物质可以达到良好的分离。
3、方法与结果
3.1对照品溶液制备
精密称取茯苓酸对照品4.9mg，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，摇匀。即配制得0.49mg/mL的茯苓酸对照品溶液。
3.2标准曲线的制备
在上述色谱条件下分别精密吸取对照品溶液（0.49mg/mL）2ul、4ul、6ul、8ul、10ul注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为横坐标茯苓酸进样质量为纵坐标，绘制标准曲线。茯苓酸质量在0.49ug-5.88ug范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为：Y=2.059×10-6X-0.121146，相关系数r=0.9997。
3.3提取条件的考察[4～6]
3.3.1提取溶剂的考察
取茯苓药材粉末（60目）约2g共5份，精密称定，分别加入甲醇、无水乙醇、乙醚、氯仿、丙酮20mL，超声提取30min（中途补充损失的溶剂），取出，放冷，过滤；用微孔滤膜（0.45ul）滤过，各进样20ul进行液相色谱分析。不同溶剂对测定结果的影响结果见表1-1。
表1-1 提取溶剂对测定结果的影响（n=3）
溶剂 甲醇 无水乙醇 乙醚 氯仿 丙酮
茯苓酸含量（%） 0.0625 0.0562 0.0525 0.0447 0.0395
以上结果表明，甲醇作为提取溶剂，得到的茯苓酸的含量最高，故选择甲醇作为供试品溶液制备的的提取溶剂。
3.3.2提取方法的考察
取茯苓药材粉末（60目）约2g，精密称定，置100mL三角瓶中，共3 份，分别加入20mL甲醇，称定重量，采用超声45min、热回流3h、冷浸24h的提取方法；取出，放冷，用甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过。取续滤液用微孔滤膜（0.45ul）滤过，各进样20ul进行液相色谱分析。结果表明，超声法提取含量最高，故选择超声处理法作为供试品溶液制备的提取方法。
3.3.3提取时间的考察
取茯苓药材粉末（过60目筛）约2g，精密称定，置100mL三角瓶中，共6份，分别加入20mL甲醇，称定重量，超声提取15min、30min、45min、60min、90min、120min，取出，放冷，用甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过。取续滤液用微孔滤膜（0.45ul）滤过，各进样20ul进行液相色谱分析。对提取时间进行考察结果见表1-2。
表1-2 提取时间对测定结果的影响（n=3）
时间（min） 15 30 45 60 90 120
茯苓酸含量（%） 0.0561 0.0579 0.0596 0.0619 0.0637 0.0612
以上结果表明，超声处理90分钟提取含量最高，故确定提取时间为90分钟，供试品溶液采用超声处理90分钟。
3.3.4粉碎粒度的选择
分别取茯苓药材粉末20目、40目、60目、80目约2g，精密称定，置100mL三角瓶中，加入20mL甲醇，称定重量，超声提取90分钟，取出，放冷，用甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过。取续滤液用微孔滤膜（0.45ul）滤过，各进样20ul进行液相色谱分析。结果表明，药材粉碎粒度为60目时，提取的茯苓酸含量最高，故确定药材粉碎过60目筛。
4、讨论
本研究筛选出茯苓酸提取条件为把茯苓粉末过60目筛后用甲醇超声提取1小时。该提取方法稳定可行。超声提取方法简便，提取率高，比常规提取方法的操作时间缩短10一20倍。超声提取天然药物有效成分具有周期短、成本低、不破坏活性成分等显著优点，用于茯苓酸的提取可以节约成本，提高效率。
参考文献
[1]国家药典委员会.《中华人民其和国药》2010年版（一部）[M].化学工业出版社，2010：224.
[2]仲兆金，刘浚.茯苓有效成分三萜的研究进展[J].中成药，2001，23（1）：58—62.
[3]张思访，刘静涵，蒋建勤等.茯苓的化学成分和药理作用及开发利用Ⅲ[J].中华实用中西医杂志，2005，18（2）：277—230.
[4]赵英博，徐斌，昝俊峰等.不同产地茯苓中茯苓酸含量的比较研究[J].中国中医药信息杂志，2009，16（7）：41—42.
[5]易中宏.茯苓药材质量标准研究[D].重庆大学，2005
[6]段启，姚丽梅，庄仪修.茯苓与茯苓皮中茯苓酸的含量比较[J].中药新药与临床药理，2010，21（6）：654—659.
作者简介
马巾媛，（1981～）女，硕士，助教，主要从事中草药鉴定方面的研究。