摘要阐述了猪苓菌的形态结构、适生条件、营养特性、培养基配方、适生树种及猪苓菌与伴生菌、蜜环菌的相互关系和诱导猪苓菌丝扭结形成菌核的相关因子,以期为猪苓菌的深入研究和人工栽培提供参考。
　　关键词猪苓菌;培养特性;伴生菌;蜜环菌;菌核形成
　　中图分类号S646.2文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)20-0105-03
　　
　　猪苓菌(Dendropolyporus umbellatus(Pers.)Jülich),别名猪苓花、猪灵芝,于实体丛生,肉质鲜美,其地下的菌核即为猪苓,是传统的真菌药物之一,在我国已有2 000多年的药用历史。现代医学证明,猪苓具有消炎、利尿、渗湿、通淋、退肿、降压、轻身耐老、抗癌、抗辐射等功能,临床上可治尿路结石、黄疸、急性肾炎、暑热水泻、全身水肿、心源性水肿、腹泻、尿急、尿频、尿道痛、肝硬化、腹水、乙型肝炎。猪苓多糖制剂对肺癌、肝癌、食道癌、宫颈癌及白血病均有较好的临床效果。随着我国医疗事业的发展,以猪苓为原料的成品药必将得到进一步开发,探索人工栽培的新途径必然会倍受关注。该文就猪苓菌的培养特性进行了阐述,以期为猪苓菌的深入研究及人工栽培提供有价值的参考。
　　
　　1菌丝的培养特性
　　
　　1.1菌落与菌丝形态结构
　　猪苓菌的分离一般可采用子实体、菌核组织分离和孢子分离。PDA、CPDA或GYA(葡萄糖-酵母粉-琼脂粉)可作为分离或母种培养基[1-3]。在PDA上,猪苓菌落呈圆形,菌丝白色,絮状,气生菌丝发达。在平板或斜面培养基上均具有较强的爬壁能力。猪苓菌色素的形成受培养基中添加的成分(如单双糖、糖醇及酪氨酸)、温度、pH值和光照等因素的影响。
　　猪苓菌丝细胞狭长,多分枝,细胞壁较薄,直径在0.95～4.50μm[2,4]之间,生殖菌丝上锁状联合突起结构明显,顶端有膨大。平行菌丝间常有長短不一的H型横向菌丝融合桥,进而形成菌丝网络。众多菌丝纠结或合并可形成直径10.0μm以上的菌索或大小为14.0～16.0μm×12.0～15.0μm的拟菌核结构。培养过程中气生菌丝可断裂形成节孢子或顶端单生或2～3个并生,椭球形,大小为3.0～16.0 μm×2.5～6.5 μm的厚垣孢子。显微观察,在猪苓菌丝间散布有形状规则、晶形完整的八面体或双锥形草酸钙结晶。用高碘酸-Schiff试剂染色老化菌丝,在老化菌丝胞壁上或老化菌丝断裂处富积有大量能被染成淡红色、圆粒状的次生代谢多糖结晶[5]。
　　1.2温度、光照和pH值对猪苓菌生长的影响
　　猪苓菌丝在5～35℃[6-8]范围内均可生长,当温度低于15～18℃时,菌丝生长速度减慢,长势一般,菌丝褐变缓慢或暂无褐变。当温度高于28～30℃时,菌丝生长速度也出现减慢,长势变差,并易出现老化变褐[9,10]。在5℃以下或35℃以上,菌丝生长几乎停滞。猪苓菌丝生长的适宜温度为24±4℃,最适温度为25℃[4,8]。
　　在黑暗和光照条件下,猪苓菌丝均可生长。但在全黑暗下菌丝生长快、长势好;全光照或12h光暗交替,菌丝生长较慢,且易出现褐变老化[6,8]。
　　有试验表明,每天给猪苓菌丝2～3h的4℃低温处理,有利于诱导其菌核的产生。一定温差(10℃)的变温处理和暗培养,可诱导猪苓菌丝直接分化子实体原基[6,8]。
　　一般而言,多数真菌都适宜在偏酸性环境中生长[11]。猪苓菌丝可以在pH值为3.5～9.0的环境下生长[4,8],但以中性偏酸(pH值4.0～7.0)的条件比较适合,pH值低于4.0或高于8.0的菌丝生长慢、长势差,易出现菌丝褐化[6-8,10]。
　　1.3菌丝生长的营养特性
　　1.3.1对碳源的利用。猪苓菌对碳源有较为宽泛的适应性。葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、麦芽糖醇、低聚异麦芽糖、甘露糖、甘露醇、低聚甘露糖、木糖、木糖醇、低聚木糖、淀粉、糊精、甘油、山梨醇、乙醇、羧甲基纤维素等都可以作为猪苓菌丝生长的碳源。其中麦芽糖、甘油、山梨醇、麦芽糖醇、低聚异麦芽糖作碳源菌丝生长速度快,气生菌丝发达,菌丝丛疏;淀粉、乙醇、半乳糖、木糖、木糖醇、低聚木糖作碳源菌丝生长速度虽然较慢,但气生菌丝极发达,菌丝丛厚,尤其是木糖醇和木糖为碳源时,气生菌丝最发达,菌丝丛最厚。葡萄糖、蔗糖、甘露糖、糊精、甘露醇、低聚甘露糖等作碳源菌丝生长速度较快,气生菌丝发达,但老化快;果糖作碳源菌丝生长速度较快,气生菌丝易组织化呈肉皮状[10,11];猪苓菌对羧甲基纤维素的利用率较低[12]。
　　1.3.2对氮源的利用。有机氮源(动物性、植物性和微生物性)比无机氮源更适合猪苓菌菌丝生长。在有机氮源中,猪苓菌丝生长速率和长势依次为:酵母膏>黄豆粉>玉米糠>蛋白胨>麸皮粉[13];在无机氮源中,猪苓菌丝生长速率和长势依次为:硝酸钠>硫酸铵>尿素[10]。猪苓菌在含尿素的培养基上,虽然径向生长缓慢,但尿素能在一定的使用浓度范围内随浓度的升高较早地促使菌丝扭结形成幼小的白色拟核,并渐变成类似于猪苓菌核表面有油漆光泽的灰黑色拟核。菌丝拟核化的立体生长自然会影响菌落的平面径向生长[14]。
　　碳氮比对猪苓菌丝生长速度有明显的影响,但对菌丝长势影响不明显。猪苓菌丝在碳氮比10～100∶1的范围内均可生长,但适宜的碳氮比为40～70∶1之间,最佳碳氮比为50∶1[13]。
　　1.3.3无机盐对猪苓菌生长的影响。无机盐是猪苓菌生命活动中不可缺少的营养物质,它们不仅具有调节渗透压、氢离子浓度、氧化还原点位的作用,还是菌体的结构、酶或辅酶的组成成分,有维持酶活的功能。无机盐的使用因培养菌种类、培养基质类型及培养方式的不同,使用剂量、作用效果也会不同,需灵活掌握。如硝酸钠(NaNO3)、柠檬酸三铵[(NH4)3C6H5O7]、磷酸氢二钾(K2HPO4)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸铵[(NH4)2SO4],按0.1%的添加量分别加入GPC(葡萄糖蛋白胨玉米浆)培养基中,硝酸钠对猪苓菌丝生长有明显促生作用,磷酸氢二钾和硫酸铵、硫酸镁作用效果不明显,柠檬酸三铵和硫酸镁对猪苓菌丝生长不利[10]。磷酸二氢钠(NaH2PO4)、硫酸钾(K2SO4)、硫酸铜(CuSO4·5H2O)、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)分别添加到相应PDA培养基中,各无机盐菌对猪苓菌丝生长有利,尤以P、Cu、Zn的促生作用更为明显。各无机盐的适宜添加量分别为:NaH2PO4 0.090g/L、K2SO4 2.000g/L、CuSO4·5H2O 0.012～0.024g/L、ZnSO4·7H2O 0.024～0.030 g/L[14]。
　　1.3.4其他添加物对猪苓菌生长的影响。在培养基中适量添加非生物物质和生物类培养液,如活性白土、硅藻土、高岭土、猪苓伴生菌水提取物、蜜环菌水提取物、假单胞杆菌(Pseudomonas alba Migula)发酵液、灵芝[Ganoderma lucidum(Legss.ex Fr.)Karst]发酵液及金针菇[Flammulina velutipes(Fr.)Sing] 发酵液等均有良好的促生作用[10,15]。
　　
　　2培养基配方对猪苓菌丝生长的影响
　　
　　不论野生猪苓,还是保存的猪苓菌株的菌丝生长对营养的需求都比较简单,可以在多种复杂或简单的半合成或合成培养基上生长。如PDA培养基、CPDA培养基、葡萄糖-硝酸钠-硫酸铵、黄豆饼粉培养基、玉米粉培养基、胡萝卜培养基、苹果培养基、麦芽汁培养基、GMY(葡萄糖-麦芽膏-酵母膏)培养基、GPC(葡萄糖-蛋白胨-玉米浆)培养基、GPY(葡萄糖-蛋白胨-酵母膏)培养基、甘油-蛋白胨-玉米浆培养基、米糠(麦麸)培养基、麦粒培养基、木屑密环菌(或猪苓菌核或榛蘑)煮汁培养基、羧甲基纤维素培养基或只有碳源和氮源的简单培养基[1,9,10,12]。其中黄豆饼粉培养基、玉米粉培养基、苹果培养基、CPDA培养基、GPY培养基、GPC培养基和麦芽汁培养基比较适合菌丝生长,而PDA培养基、GMY培养基、麦粒培养基、麦麸培养基、胡萝卜培养基、木屑密环菌、猪苓菌核或榛蘑煮汁等培养基次之[1],葡萄糖-硝酸钠-硫酸铵、羧甲基纤维素培养基较差[1,10]。但猪苓菌在初始接种菌丝生长较差的培养基上,经过1～2次转接后可逐渐适应培养基质,菌丝生长速度会有所提高[1]。
　　麦芽汁培养以及以甘油(2.5%～7.5%)、甘露醇(2.5%～15%)[16]为碳源的培养基,不仅容易诱导猪苓菌丝形成拟核,同时,还利于菌丝体产生猪苓酮类生物活性物质[10]。
　　猪苓菌丝的液体培养可分为静态浅层培养、振荡培养和通气培养。适宜于静态浅层培养的配方为:麦芽汁液体培养基[17]、葡萄糖 马铃薯煮汁 蜜环菌煮汁培养基(pH值5.0)、麦芽糖 蜜环菌煮汁 麦麸煮汁培养基(pH值5.0)[18]、鲜苹果250g、蛋白胨5g、麦芽糖15g、磷酸二氢钾0.75g、硫酸镁0.75g、V■ 75mg培养基(pH值3.9)[19]。适宜于振荡培养的配方为:玉米面液体培养基[18]、玉米粉30g、酵母膏30g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 1.0g、CaCO3 1.0 g、V■ 0.lg培养基(pH值5.8)[20]。适宜于通气培养的配方为:可溶性淀粉20g、豆饼粉提取液300mL、玉米浆20mL、硫胺素0.5g(pH值6.5)[17]。液体培养以进入稳定期(培养第13～18d)菌丝体多糖含量最高。
　　
　　3猪苓菌在不同树种段材上的生长
　　
　　Choi Kyoung-dal等将猪苓菌丝体分别接种在经过灭菌的16种树木段材(直径15cm,长30cm)上,置于塑料袋中,在20℃黑暗条件下,培养10周后观察,结果猪苓菌丝能在16种树的段材上生长。其中野茉莉(Styrax japonica)、柿树(Diospyros kaki)、阔叶红松(Pinus koraiensis)、朝鲜紫茎(Ste-wartia koreana)、日本桤木(Alnus japonica)、灯台树(Cornus con-troversa)、Populus alba×tomentiglandulosa、鸡爪槭(Acer palmatum)、樱花(Prunus serrulata)和刺槐(Robinia pseudo-acacia)上菌丝相对生长旺盛,菌丝浓密。在野茉莉、朝鲜紫茎、灯台树、Populus alba× tomentiglandulosa、鸡爪槭上还可形成菌核[4]。
　　
　　4猪苓菌与蜜环菌、伴生菌的关系
　　
　　1955年川村清一在猪苓菌核上首次观察到有蜜环菌索存在[21],21世纪初郭顺星等从野生猪苓穴中分离到了一株猪苓菌伴生菌[22]。至此人们开始了猪苓菌与蜜环菌和伴生菌相互关系的探究[23]。
　　4.1猪苓菌、伴生菌单独培养
　　尽管猪苓菌与伴生菌在同种或不同培养基上单独培养时,二者菌落的外部形态差异较大。但二者的菌丝形态比较接近,且菌丝提取物在247nm处的化学指纹图谱相似。对猪苓菌与伴生菌的5.8SrDNA及其两侧的ITS1区和ITS2区序列分析表明,伴生菌的ITS序列全长628bp,而猪苓菌的ITS全长序列均为626bp,相似性达99.36%[24],可见伴生菌与猪苓在分子进化上有着极高的亲缘性,伴生菌是多孔菌属中的一个种(polyporus sp.)。
　　4.2猪苓菌与蜜环菌共培养
　　猪苓菌与蜜环菌共培养时,两菌接触面无拮抗线出现,当蜜环菌菌索侵入猪苓菌落时(约深入猪苓菌落0.5cm处),很快就遭到猪苓菌强烈的阻遏反应,形成封锁菌索延伸的隔离腔,并反侵染于蜜环菌菌索的皮层细胞及侵染带边缘细胞,导致环菌菌索内部中空化[25]。蜜环菌则以消化腔内猪苓菌丝获取营养,当隔离腔中猪苓菌丝被消化消耗殆尽时,由于蜜环菌無法产生新生菌索而突破隔离腔,因此不能获得新的营养补给而出现生活力减弱,最终在隔离腔中溶解反而成为猪苓菌的营养。隔离腔和反侵入机构则成为猪苓菌从蜜环菌中获取营养的通道,使猪苓菌核得以发育[26]。猪苓菌与蜜环菌的关系是一种寄生与反寄生的共生营养关系。
　　4.3猪苓菌与伴生菌共培养
　　猪苓菌在单独培养时很少有菌丝束的分化。当猪苓菌与伴生菌共培养时,在两菌充分接触界面处先形成一个菌丝交融带,继后形成结构致密、拱形隆起、红褐色的拮抗线。拮抗线中央为一些不具生活力的死细胞,靠近拮抗线的猪苓菌丝细胞膨大而中空,细胞壁单侧加厚。而靠近拮抗线的伴生菌菌丝细胞也中空,但细胞壁不增厚或略有增厚。拮抗线隆起的顶层细胞逐渐分化成表皮老化后脱落。随着伴生菌色素的分泌,培养基逐步变褐,猪苓菌落表面菌丝分化产生大量菌丝束,从菌丝束交织的地方分化出菌核原基。伴生菌是猪苓菌丝分化形成菌核的重要生物调控因子[27-29]。
　　4.4蜜环菌与伴生菌共培养
　　蜜环菌与伴生菌共培养时,伴生菌长势远不如单独培养时健壮。在蜜环菌影响下,菌落直径仅至1cm左右便停止生长,伴随菌落颜色变暗、表面干燥,最终完全凋亡。蜜环菌能穿透整个伴生菌菌落,在伴生菌菌落下方产生大量细小分枝。蜜环菌与伴生菌的关系也是一种寄生与反寄生的共生营养关系。显微结构观察提供了有力的佐证:侵入到伴生菌菌落内的蜜环菌菌索成近中空状,只残存少量不具生活力的髓部菌丝。在蜜环菌的皮层上,也明显存有伴生菌侵入蜜环菌皮层细胞的侵入点,并使皮层细胞由外向内瓦解[30]。尽管如此,由于伴生菌长势较弱,竞争不过蜜环菌,最终逃脱不了凋亡的厄运。但从另一个角度反映出伴生菌对蜜环菌有促使漆状物分泌、保持蜜环菌生长旺盛并不断产生新菌索和分枝的良好作用,比猪苓菌更适合蜜环菌寄生。
　　4.5猪苓菌、伴生菌和蜜环菌共培养
　　猪苓菌、伴生菌和蜜环菌三者共同培养,猪苓对蜜环菌的防御能力有所下降,表现为蜜环菌侵入猪苓菌落更深入(侵入菌落1.5cm),猪苓菌丝也不能形成完整的防御区。猪苓菌与伴生菌之间只形成一个菌丝交融区,不再形成拮抗线。由于猪苓菌的存在,使得伴生菌对蜜环菌的耐受力有所提高,即使蜜环菌产生的新分枝均向伴生菌一侧生长,但伴生菌依然保持活力。猪苓菌和伴生菌均能在蜜环菌菌索皮层上形成侵入位点[30],建立寄生关系,获得各自所需营养。
　　猪苓菌与伴生菌、蜜环菌构成了一个既相互关联又相互制约的营养循环体系。伴生菌是猪苓菌核形成关键所在,而蜜环菌与菌核形成的关系不大,只是在猪苓菌核形成后才侵染菌核,是猪苓菌核继续生长发育的关键。野生状态下,蜜环菌一般不侵入当年新生白苓,只能侵染越冬后的灰苓和黑苓。
　　另外,有報道指出,以猪苓菌丝体接种在灭菌的木段上,在无伴生菌或蜜环菌的情况下依然可以形成菌核[4];陈德育等[8]用棉皮木屑混合培养基(pH值自然),在25℃下培养,菌丝长至菌袋的1/3时,置于室温(20～22℃)、空气相对湿度80%的条件下,3周后室内自然光照处理下可形成菌核组织,完全黑暗处理能在袋口较快地形成菌核。刘瑛颖等[16]对用GPC培养基所诱导的菌核进行了分析,其形态学和化学指标成分与野生菌核相似。可见,诱导猪苓菌核形成的因子较多,伴生菌也绝非是唯一的关键因子。因此,对猪苓菌核的形成机理仍需进行深入系统的探究。
　　
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