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摘要：通过对肠炎沙门氏菌在新鲜番茄不同部位的存活情况，包括模式、时间的研究，旨在对番茄中沙门氏菌污染进行风险分析并为找到肠炎沙门氏菌在番茄上附着与存活最小化的干预方法提供科学依据。采用不同处理方法对番茄上肠炎沙门氏菌的生存量进行研究，包括不同人工污染程度及部位，不同贮存时间和温度，分别取番茄污染表皮处和果肉进行沙门氏菌定性和MPN法定量检测，并结合电镜观察番茄表面结构，分析附着渗透可能。结果表明：番茄表皮及果蒂多孔形态给微生物的附着和渗透提供一定的条件，人工接种30d后，仍可在番茄果皮、果肉、果蒂处分离到肠炎沙门氏菌，并且附着与渗透易发生在果蒂和破损表皮处。因此，沙门氏菌可长期存活于番茄表皮及内部，表面多孔结构保护肠炎沙门氏菌免受清洗的影响，为生食带来安全隐患。
关键词：番茄；肠炎沙门氏菌；附着；渗透
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2016）01-0061-04
0 引言
果蔬感染微生物的途径贯穿整个生产、加工、流通环节，特别是加工及贮藏期的二次污染。2008年美国爆发的番茄沙门氏菌污染事件就造成了上千人感染。近几年，国内多名研究者对我国果蔬微生物性食品安全提出了很多意见和建议，包括管理的提高和相关产品方法及检测方法的推进。对于番茄中天然抗菌素番茄碱的研究也有不少，但其抑菌作用主要针对真菌和一些腐败菌，鲜见沙门氏菌在番茄上存活情况的研究。果蔬表面有天然的微生物群落，一般由有益微生物组成，且番茄pH值在4-5之间，属于弱酸性果蔬，所以，通常番茄表面及内部并不能给沙门氏菌提供最适生长环境，有研究者也做过相关的报道。但是，当沙门氏菌污染番茄后，他在番茄中存活情况尚需研究。
本文采用人工染菌的方法，通过对肠炎沙门氏菌在番茄上的存活时间及内化情况进行研究，旨在为番茄中沙门氏菌污染风险分析和找到沙门氏菌在番茄上附着与存活最小化的干预方法提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
试剂及培养基：缓冲蛋白胨水（0.1%）、TTB、SC、沙门氏菌科玛嘉显色培养基均购于杭州微生物试剂公司；ID32E试剂条、JAMES试剂、氧化酶购于生物梅里埃公司；标准菌株：肠炎沙门氏菌（CICC21482）购于中国工业微生物菌种保存管理中心。
样品：番茄（确认无沙门氏菌污染）。
仪器和设备：高压灭菌锅，上海三申FM75；DHP-9082培养箱（上海-恒科学仪器有限公司）；拍击式均质器（宁波新芝）；Baby Gravimat重量稀释仪（法国Interscience）；ATB微生物鉴定仪（法国梅里埃公司）；JSM-7500F型扫描电子显微镜（日本电子）；HF safe-1200生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 人工染菌
将肠炎沙门氏菌（CICC21482）制备成一定的麦氏浓度标准菌株菌悬液，对样品分别用浸蘸和点植两种方法进行人工污染。浸蘸接种，优点是可模拟严重灌溉污染、径流污染与水槽灌溉污染。点植接种，可比较不同部位附着情况，且各接种点接种量均匀一致。本文同时采用以下几种方法进行人工染菌：样品浸在菌悬液中，菌悬液点植在番茄果蒂、光滑表面、有破损表面处。
1.2.2 样品放置
一般市售番茄都在红熟期，不同天气的储存期有所不同，按照饮食习惯通常不超过半个月就会被食用，将制备好的样品静置于低温5℃和常温20℃下，分别放置在5，15d后进行定量实验，定性实验延长至30d。
1.2.3 样品检测
浸蘸接种的样品需检测样品表皮、果肉，点植接种的样品需检测各点植部位表皮及内部果肉。在做表皮分析时，结合Annous等从瓜皮表面回收细菌的方法，将待检番茄用超声波清洗，达到回收表皮微生物的目的，果肉部分则直接无菌切取。定性检测方法参照GB 4789.4-2010《食品微生物学检验沙门氏门菌检验》，称取25g样品至225mL BPW进行前增菌、取1mL前增菌液至TTB和SC进行二次增菌、划线到XLD和科玛嘉显色培养进行分离、最后通过ATB生化鉴定仪进行生化鉴定并做血清确认。定量检测方法参照SN/T 0040-1992《出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）计数检验方法行业标准》及张秀丽等关于两种沙门氏菌定量计数方法比较，采用最大可能数（MPN）法，将样品按不同稀释度接种到3组增菌液中，每组3管，共9管，分离鉴定方法同定性方法，最后查MPN表得到结果。
1.2.4 电镜实验
将番茄表皮和果蒂切片，自然干燥后，扫描电子显微镜观察。
2 结果与分析
通过生化及血清实验，定性确认，结果见表1。由表可知，ATB最终结论为，细菌名称：沙门菌属（Salmonella spp）；评语：极好的鉴定；ID%：99.9%；T值：0.88。其中，ID%（鉴定百分率）评估了待测菌的测定结果谱与数据库中不同分类的相对接近程度，T值评估了待测菌的测定结果谱与每一种分类最典型的反应结果谱的符合程度。血清试验：沙门氏菌多价A-F凝集。
通过定性实验研究肠炎沙门氏菌在番茄果皮及果肉上存活时间，结果见表2。由表可知，肠炎沙门氏菌在番茄上的存活时间与番茄本身被污染程度、环境温度、被污染部位有关。番茄被接种该菌30d后，仍可在果皮、果肉、果蒂痕部被分离到。低温（5℃）下的存活时间低于常温（20℃）；浸蘸接种，即严重污染后该菌的存活时间也较点植接种后存活时间要长。与完整果皮相比，该菌在破损果皮及果蒂处的存活时间更长。这是由于完整果皮由蜡质的角质层组成，与其他部位相比不利于人类病原菌附着。
通过定量实验研究肠炎沙门氏菌在在番茄果皮及果肉上存活量，结果见表3。可以看出，本文所用标准菌株对番茄果蒂的附着能力整体高于对果皮的附着；常温（20℃）下的附着能力高于低温（5℃）；15d后的附着量要少于5d；对完整表皮通过浸蘸接种后进入果肉的能力略强于点植接种；而该菌通过破损表皮及果蒂处进入果肉的能力相对较强，所以细菌可通过伤口快速内化，微生物通常通过表皮渗入或间接通过气孔、皮孔、排水器或伤口等进入植物体内，这些都是有助于微生物内化的植物结构。
通过电镜实验观察番茄表皮及果蒂处形态，如图l所示。由图可见，番茄表面光滑但也具有网状多孔组织，所以微生物在其表皮的附着能力较低，但可通过渗透进入组织内部。而果蒂组织存在大量的孔状结构，而且凹凸不平，这样的组织结构为微生物提供了大量的附着位点，同时，可能的内化也易于发生在该处。这与本文结果相符。
3 结束语
在有关肠道病原菌对植物潜在附着因子的研究中发现，l型菌毛、IVB纤毛和细聚合菌毛都是肠炎沙门氏菌的吸附因素。而番茄表面天然形成的缝隙、伤口以及果蒂都是微生物附着和内化的主要途径，但是各部位附着及内化程度有差异，同时也受初始污染程度、环境温度的影响。严重污染后30d仍可在表皮及果肉处分离到该菌，即便是轻微污染，20d后仍可能分离到该菌，所以肠炎沙门氏菌在番茄上的附着和内化能力较强。本研究也表明，20℃下的存活能力明显高于5℃，与前人发现的沙门氏菌在莴苣、生菜上的存活时间和温度类似。
所以，高温季节更有利于微生物的生长，虽然生食蔬菜时都会经过清洗，但对果蔬的表面清洗并不能完全消除其安全隐患。通过电镜观察，番茄表皮及果蒂形态给微生物的附着和渗入提供了一定条件，同时保护肠炎沙门氏菌免受清洗的影响。建议消费者选购番茄时，应注意有无创伤，果皮是否完整。应冷藏贮存，清洗时特别注意缝隙处并去除果蒂部分。
关键词：番茄；肠炎沙门氏菌；附着；渗透
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2016）01-0061-04
0 引言
果蔬感染微生物的途径贯穿整个生产、加工、流通环节，特别是加工及贮藏期的二次污染。2008年美国爆发的番茄沙门氏菌污染事件就造成了上千人感染。近几年，国内多名研究者对我国果蔬微生物性食品安全提出了很多意见和建议，包括管理的提高和相关产品方法及检测方法的推进。对于番茄中天然抗菌素番茄碱的研究也有不少，但其抑菌作用主要针对真菌和一些腐败菌，鲜见沙门氏菌在番茄上存活情况的研究。果蔬表面有天然的微生物群落，一般由有益微生物组成，且番茄pH值在4-5之间，属于弱酸性果蔬，所以，通常番茄表面及内部并不能给沙门氏菌提供最适生长环境，有研究者也做过相关的报道。但是，当沙门氏菌污染番茄后，他在番茄中存活情况尚需研究。
本文采用人工染菌的方法，通过对肠炎沙门氏菌在番茄上的存活时间及内化情况进行研究，旨在为番茄中沙门氏菌污染风险分析和找到沙门氏菌在番茄上附着与存活最小化的干预方法提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
试剂及培养基：缓冲蛋白胨水（0.1%）、TTB、SC、沙门氏菌科玛嘉显色培养基均购于杭州微生物试剂公司；ID32E试剂条、JAMES试剂、氧化酶购于生物梅里埃公司；标准菌株：肠炎沙门氏菌（CICC21482）购于中国工业微生物菌种保存管理中心。
样品：番茄（确认无沙门氏菌污染）。
仪器和设备：高压灭菌锅，上海三申FM75；DHP-9082培养箱（上海-恒科学仪器有限公司）；拍击式均质器（宁波新芝）；Baby Gravimat重量稀释仪（法国Interscience）；ATB微生物鉴定仪（法国梅里埃公司）；JSM-7500F型扫描电子显微镜（日本电子）；HF safe-1200生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 人工染菌
将肠炎沙门氏菌（CICC21482）制备成一定的麦氏浓度标准菌株菌悬液，对样品分别用浸蘸和点植两种方法进行人工污染。浸蘸接种，优点是可模拟严重灌溉污染、径流污染与水槽灌溉污染。点植接种，可比较不同部位附着情况，且各接种点接种量均匀一致。本文同时采用以下几种方法进行人工染菌：样品浸在菌悬液中，菌悬液点植在番茄果蒂、光滑表面、有破损表面处。
1.2.2 样品放置
一般市售番茄都在红熟期，不同天气的储存期有所不同，按照饮食习惯通常不超过半个月就会被食用，将制备好的样品静置于低温5℃和常温20℃下，分别放置在5，15d后进行定量实验，定性实验延长至30d。
1.2.3 样品检测
浸蘸接种的样品需检测样品表皮、果肉，点植接种的样品需检测各点植部位表皮及内部果肉。在做表皮分析时，结合Annous等从瓜皮表面回收细菌的方法，将待检番茄用超声波清洗，达到回收表皮微生物的目的，果肉部分则直接无菌切取。定性检测方法参照GB 4789.4-2010《食品微生物学检验沙门氏门菌检验》，称取25g样品至225mL BPW进行前增菌、取1mL前增菌液至TTB和SC进行二次增菌、划线到XLD和科玛嘉显色培养进行分离、最后通过ATB生化鉴定仪进行生化鉴定并做血清确认。定量检测方法参照SN/T 0040-1992《出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）计数检验方法行业标准》及张秀丽等关于两种沙门氏菌定量计数方法比较，采用最大可能数（MPN）法，将样品按不同稀释度接种到3组增菌液中，每组3管，共9管，分离鉴定方法同定性方法，最后查MPN表得到结果。
1.2.4 电镜实验
将番茄表皮和果蒂切片，自然干燥后，扫描电子显微镜观察。
2 结果与分析
通过生化及血清实验，定性确认，结果见表1。由表可知，ATB最终结论为，细菌名称：沙门菌属（Salmonella spp）；评语：极好的鉴定；ID%：99.9%；T值：0.88。其中，ID%（鉴定百分率）评估了待测菌的测定结果谱与数据库中不同分类的相对接近程度，T值评估了待测菌的测定结果谱与每一种分类最典型的反应结果谱的符合程度。血清试验：沙门氏菌多价A-F凝集。
通过定性实验研究肠炎沙门氏菌在番茄果皮及果肉上存活时间，结果见表2。由表可知，肠炎沙门氏菌在番茄上的存活时间与番茄本身被污染程度、环境温度、被污染部位有关。番茄被接种该菌30d后，仍可在果皮、果肉、果蒂痕部被分离到。低温（5℃）下的存活时间低于常温（20℃）；浸蘸接种，即严重污染后该菌的存活时间也较点植接种后存活时间要长。与完整果皮相比，该菌在破损果皮及果蒂处的存活时间更长。这是由于完整果皮由蜡质的角质层组成，与其他部位相比不利于人类病原菌附着。
通过定量实验研究肠炎沙门氏菌在在番茄果皮及果肉上存活量，结果见表3。可以看出，本文所用标准菌株对番茄果蒂的附着能力整体高于对果皮的附着；常温（20℃）下的附着能力高于低温（5℃）；15d后的附着量要少于5d；对完整表皮通过浸蘸接种后进入果肉的能力略强于点植接种；而该菌通过破损表皮及果蒂处进入果肉的能力相对较强，所以细菌可通过伤口快速内化，微生物通常通过表皮渗入或间接通过气孔、皮孔、排水器或伤口等进入植物体内，这些都是有助于微生物内化的植物结构。
通过电镜实验观察番茄表皮及果蒂处形态，如图l所示。由图可见，番茄表面光滑但也具有网状多孔组织，所以微生物在其表皮的附着能力较低，但可通过渗透进入组织内部。而果蒂组织存在大量的孔状结构，而且凹凸不平，这样的组织结构为微生物提供了大量的附着位点，同时，可能的内化也易于发生在该处。这与本文结果相符。
3 结束语
在有关肠道病原菌对植物潜在附着因子的研究中发现，l型菌毛、IVB纤毛和细聚合菌毛都是肠炎沙门氏菌的吸附因素。而番茄表面天然形成的缝隙、伤口以及果蒂都是微生物附着和内化的主要途径，但是各部位附着及内化程度有差异，同时也受初始污染程度、环境温度的影响。严重污染后30d仍可在表皮及果肉处分离到该菌，即便是轻微污染，20d后仍可能分离到该菌，所以肠炎沙门氏菌在番茄上的附着和内化能力较强。本研究也表明，20℃下的存活能力明显高于5℃，与前人发现的沙门氏菌在莴苣、生菜上的存活时间和温度类似。
所以，高温季节更有利于微生物的生长，虽然生食蔬菜时都会经过清洗，但对果蔬的表面清洗并不能完全消除其安全隐患。通过电镜观察，番茄表皮及果蒂形态给微生物的附着和渗入提供了一定条件，同时保护肠炎沙门氏菌免受清洗的影响。建议消费者选购番茄时，应注意有无创伤，果皮是否完整。应冷藏贮存，清洗时特别注意缝隙处并去除果蒂部分。