【摘 要】
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目的:构建小鼠核受体亚家族1组D成员1(NR1D1)基因的过表达载体,分析小鼠NR1D1蛋白的基本特征.方法:从小鼠肝脏组织中提取总RNA,反转录后获得cDNA,采用PCR技术扩增得到小鼠NR1D1基因的编码区片段,经同源重组与pcDNA3.1载体相连接,将酶切鉴定和测序正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-NR1D1.将pcDNA3.1空质粒和pcDNA3.1-NR1D1重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为对照组和pcDNA3.1-NR1D1转染组,48 h后提取总RNA和总蛋白样品,通过实时
【机 构】
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西北农林科技大学动物医学院临床兽医系,陕西 杨凌 712100;西北农林科技大学 农业农村部动物生物技术重点实验室,陕西 杨凌 712100
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目的:构建小鼠核受体亚家族1组D成员1(NR1D1)基因的过表达载体,分析小鼠NR1D1蛋白的基本特征.方法:从小鼠肝脏组织中提取总RNA,反转录后获得cDNA,采用PCR技术扩增得到小鼠NR1D1基因的编码区片段,经同源重组与pcDNA3.1载体相连接,将酶切鉴定和测序正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-NR1D1.将pcDNA3.1空质粒和pcDNA3.1-NR1D1重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为对照组和pcDNA3.1-NR1D1转染组,48 h后提取总RNA和总蛋白样品,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blotting法检测2组细胞中NR1D1 mRNA和蛋白表达水平.使用DNAStar和MEGA7软件对小鼠与其他物种的NR1D1基因编码区序列(CDS)进行相似性分析,并构建系统进化树;利用ExPASy、ProtScale、SingalP5.0、TMHMM-2.0、PhosphoSitePlus?、SOPMA和SWISS-MODEL等在线工具分析NR1D1蛋白的氨基酸组成、亲/疏水性、跨膜区域、信号肽、二级结构和三级结构.结果:酶切鉴定和测序结果均表明过表达载体pcDNA3.1-NR1D1构建成功.与对照组比较,pcDNA3.1-NR1D1转染组细胞中NR1D1 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01).生物信息学分析,小鼠NR1D1 CDS区与人、大鼠、中国仓鼠、黑猩猩、兔、犬、猪、马、牛、绵羊、山羊、家猫和斑马鱼的相似性分别为90.0％、94.8％、86.5％、90.0％、89.6％、88.3％、89.7％、89.8％、88.8％、89.1％、89.1％、89.7％和65.1％.系统进化树分析,小鼠NR1D1基因与中国仓鼠和大鼠的遗传距离最近,与斑马鱼的遗传距离最远.小鼠NR1D1蛋白是一种疏水性碱性蛋白质,不属于分泌蛋白和跨膜蛋白,含有12个磷酸化位点和10个泛素化位点;二级结构中无规则卷曲占54.63％,α-螺旋占26.50％,延伸链占12.68％,β-转角占6.18％;三级结构预测,小鼠与人的NR1D1蛋白相似度大,差异较小.结论:成功构建了小鼠NR1D1基因过表达载体pcDNA3.1-NR1D1,验证了其在HEK293T细胞中的过表达效果,为进一步研究NR1D1基因及其蛋白的功能提供了依据.
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