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【摘要】 目的 采用脐血CD34+>/sup>细胞在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下体外分化扩增为成熟树突状细胞。方法 应用CD34+>/sup>干细胞分选试剂盒以及免疫磁珠法从脐血中分离CD34+>/sup>细胞，用rhGM-CSF、rhTNF-α联合诱导分化发育14 d，成为成熟DC，观察细胞形态及检测CD83分子表达。结果 50 ml脐带血可分离出CD34+>/sup>细胞约1.1×106>/sup>,在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下CD34+>/sup>干细胞培养2周，约扩增10～20倍。CD34+>/sup>干细胞培养第3 d开始出现集落，第8～9天集落最大，CD34+>/sup>干细胞分化发育为有树突状突起的成熟DC，表面分子CD83阳性率为81.7%。结论 体外联合运用rhGM-CSF、rhTNF-α,能够成功诱导脐血CD34+>/sup>细胞分化为大量成熟的DCs。
【关键词】 树突状细胞； 脐血 CD34+>/sup>细胞； rhGM-CSF； rhTNF-α； 体外培养
Induction and amplification of dendritic cells derived from human cord blood CD34+>/sup> cells in vitro CHEN Dong-xiao,ZHU Yuan-feng,WU Lin.The Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515041,China
【Abstract】 Objective The proliferation of human dendritic cells （DCs） from cord blood CD34+>/sup> cells induced by rhGM-CSF、rhTNF-α was observed.Methods CD34+>/sup> hematopoietic stem cells were isolated from healthy human cord blood using CD34+>/sup> progenitor cell isolated kit by a high-gradient magnetic cells sorting system（MACS）.The CD34+>/sup> cells were expanded with rhGM-CSF and rhTNF-α for 2 weeks. CD83 was analysed by means of flowcytometry.Results About 1.1×106>/sup> CD34+>/sup> cells were cultured, expanded and isolated from 50 ml cord blood:CD34+>/sup> stem cells were cultured in the presence of rhGM-CSF and rhTNF-α,and the cells were expanded 10～20-fold after 2 weeks. In the culture system,the small colony occur in the 3rd day,when expanded,the colony augment gradually and achieve the largest in the 8th to 9th day.About 81.7% expanded cells expessed CD83.Conclusion The in vitro culture system with rhGM-CSF and rhTNF-αcan effectively induce cord blood CD34+>/sup> cells to differentiate into dendritic cells.
【Key words】 Dendritic cell； Cord blood； CD34+>/sup>cell； rhGM-CSF； rhTNF-α； Cell culture in vitro
树突状细胞（dendritic cell，DC）是体内功能最强的一类专职性抗原递呈细胞，同时也是唯一能直接激活初始型T细胞的抗原递呈细胞，能通过MHC-Ⅰ将抗原递呈给CD8+细胞，激活细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL），从而发挥特异性杀伤作用［1］。无论是在机体免疫机制的研究还是应用于免疫治疗,DCs一直是研究的热点,特别是在肿瘤免疫中的地位越来越引起重视［2，3］。采用外周血单个核细胞体外诱导分化的方法培养DCs最终收获的DCs数量较少且活力和纯度都不高。而脐血来源广泛，取材方便，移植要求的HLA相合位点低，通过脐血CD34+>/sup>细胞分离扩增DC，有很大的实用价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 脐血 新鲜脐血50 ml,来源于汕头大学医学院第二附属医院健康产妇脐静脉血，经肝素（20 U/ml）抗凝。
1.1.2 主要试剂 Min-MACS磁式细胞分选器及CD34+>/sup>细胞分离试剂盒，CD34＋细胞分离盒包括试剂A：非特异性抗体阻断剂；试剂B：CD34+>/sup>磁珠单抗（Miltenyi Biotec公司）、rhGM-CSF（Sigma公司）、rhTNF-α（PePRO Tech Ec LTD）、FITC-CD83 micron-Ab1、FITC-mouse antihuman IGG1（e Bio Science公司）。淋巴细胞分离液及胎牛血清（天津TBD公司），DMEM/F12培养液（Gibico产品），BSA（Sigma公司）。
1.2 方法
1.2.1 脐血CD34+>/sup>细胞的分选 新鲜抗凝脐血经等量D-Hanks液稀释，再缓慢加于等量淋巴细胞分离液上，离心（2000 rpm，20 min，20 ℃），吸取白膜层细胞，分离出脐血单个核细胞。每108个单核细胞加入100 μl试剂A1，混匀后再加入100 μl试剂A2，6 ℃孵育30 min。采用Min-MACS磁式细胞分选器，经磁性细胞分离柱分选,收集CD34+>/sup>细胞,用台盼蓝染色并细胞计数。
1.2.2 CD34+>/sup>细胞诱导分化 将CD34+>/sup>干细胞悬浮于10% FBS DMEM+ F12培养液中，调整细胞浓度为1×105>/sup>/ml。每个培养瓶加入5 ml培养基，并加入细胞因子rhGM-CSF 200 ng/ml、rhTNF-α 100 ng/ml，在37 ℃、5% CO2 饱湿条件下培养14 d，培养过程中隔日或3.5 d保留换液并加相应细胞因子。2周后收集细胞行台盼蓝染色检测细胞活力并计数。
1.2.3 形态观察 培养过程中每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况、形态变化并拍照。
1.2.4 流式细胞仪检测树突状细胞CD83分子的表达 收集培养14 d的DC用冷Buffer（PH 7.2 PBS + 150 mM NaCl + 0.09% NaN3 + 0.2% BSA）悬浮为1×106>/sup>/ml，每管加入100 μl细胞悬液。每管加入20 μl FITC-CD83，对照管加20 μl FITC-IgG，4 ℃避光过夜。适量Buffer洗涤细胞。弃上清，加Buffer 1 ml,混匀。流式细胞仪 （FACS Calibur SE，美国BD公司）按说明上机检测。Winmdi 2.9软件分析结果。
1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行分析,所有数据均以x±s表示,
2 结果
2.1 细胞形态 50 ml脐带血可分离出CD34+>/sup>细胞（1.1±0.2）×106>/sup>，台盼蓝染色（95±1）%呈阴性。在细胞因子GM-CSF及TNF-α联合作用下，经14 d体外培养，CD34+>/sup>干细胞发育为成熟树突状细胞，扩增10～20倍。倒置显微镜下，CD34+>/sup>干细胞呈圆形，胞体小，在培养液中悬浮生长。在细胞因子作用下，CD34+>/sup>干细胞逐渐生长，第2天即可见部分细胞体积增大，但尚未见有集落生成。第3天开始，细胞开始形成集落，且细胞形态开始由圆形逐渐变成不规则形状。随着细胞的分裂增殖，细胞数量增多，集落逐渐变大，且在集落边缘呈毛刺状，周围可见有树突样突起的细胞。集落在第8～9 d最大，以后逐渐减小，散在悬浮细胞增多。随着细胞的逐渐成熟，大量的DC从集落中脱落，半悬浮生长于培养液中，其体积大小不一，形态多样，有的短而粗，有的细长，可见分支，表面呈毛刺状。典型的成熟DC呈星型或不规则状，有较多的树突状突起。培养体系中尚可见极少数的单核细胞和巨噬细胞。
2.2 成熟DC表面分子CD83表达 培养14 d的DC表面分子CD83用流式细胞仪检测，表达率为（81.7±1.2）%。
3 讨论
免疫磁珠技术是由20世纪70年代起步，80年代兴起的一种新技术，近年来在细胞分离纯化方面，特别是树突状细胞分离方面取得巨大的进展。本实验采用免疫磁珠法分离CD34+>/sup>细胞，简单方便，获得足够量的CD34+>/sup>细胞，且用CD34抗体标记的微磁珠并不影响CD34+>/sup>细胞的扩增和向DC方向分化，不影响DC的成熟与功能。
有实验［4］显示，不同的DC前体细胞增殖能力差异明显，诱生获得DC的时间和获取DC的效率也不一样。外周血单个核细胞来源的DC形成早，7～9 d即可分化成熟，但整个分化过程中细胞总量增生不明显。Caux等［5］发现，将脐血CD34+>/sup>细胞置于含有c-kit配体、GM-CSF和TNF-α的培养基中诱导5～7 d后，细胞分为CD14+>/sup>、c-fms+>/sup>、CD1a->/sup>和CD14->/sup>、c-fms->/sup>、CD1a+>/sup>两类细胞亚群。继续培养，前者可分化为巨噬细胞或者树突状细胞，后者先分化为具有郎格罕细胞特征的细胞；培养至12～14 d，再进一步分化为成熟的树突状细胞［6］。所以CD34+>/sup>细胞来源的DC形成晚，分化成熟需14 d，但分化过程中伴随细胞数量增殖。相同数量的脐血,后者扩增DC的效率明显高于前者。
笔者采用免疫磁珠法从脐血分离CD34+>/sup>细胞，纯度在95%以上，50 ml脐血分离出约1.1×106>/sup> 个CD34+>/sup>细胞，进行体外培养，在细胞因子作用下，发育为成熟的DC在80%以上，扩增量为10～20倍，足够于进一步的研究应用。
如果单独应用GM-CSF诱导，CD34+>/sup>前体细胞只能分化为粒细胞和巨噬细胞，而将GM-CSF与TNF-α联合应用，则可诱生出树突状细胞克隆。GM-CSF不但能诱导一系列特征性启动因子的表达以启动树突状细胞的分化［7］，而且能上调树突状细胞表达CD86，使成熟树突状细胞活化。而TNF-α对树突状细胞的成熟特别是在终末分化中有明显的促进作用。同时，TNF-α与GM-CSF联合应用可发挥两者的协同作用。TNF-α作为第一信号，上调树突状细胞前体的GM-CSF受体，使其达到一定的阈值，以接受GM-CSF的刺激，引导前体细胞向树突状细胞分化［6］。本实验联合应用TNF-α与GM-CSF诱导CD34+>/sup>细胞，第3天开始出现集落，第9天集落最大，以后集落变小，培养液中大部分为半悬浮细胞。培养14 d后，细胞发育为成熟的树突状细胞。
CD83被认为是树突状细胞充分成熟的标记，笔者对培养14 d的树突状细胞经流式细胞仪检测CD83分子，阳性率为81.7%，说明细胞在2周培养后，大部分分化发育成熟。
本实验结果表明,人脐血CD34+>/sup>干细胞在rhGM-CSF、rhTNF-α联合诱导下，经14 d扩增培养，分化发育为大量高纯度、形态功能成熟的DC，此方法简便可靠，有很大的实用价值，为树突状细胞的应用研究打下了坚实的基础。
参 考 文 献
［1］ Koopmann JO,Hammeiling GJ,Momburg F.Generation,intracellular tramsport and loading of peptides associated with MHC class Ⅰmolecules.Curr Opin Immunol,1997,9（1）:80-88.
［2］ HsuAK,KerrBM,JonesKL,et al.RNA loading of leukemic antigens into cord blood derived dendritic cells for immunotherapy.Biol Blood Marrow Transplant,2006,12（8）:855-867.
［3］ Guo G,Chen S,Zhang J,et al.Antitumor activity of a fusion of esophageal carcinoma cells with dendritic cells derived from cord blood.Vaccine,2005,23（45）:5225-5230.
［4］ 裴莉,陈洁平.人脐血不同前体细胞体外诱导分化为树突状细胞的研究.重庆医学,2004,33（6）:835-837.
［5］ Caux C,Massacrier C,Vanbervliet B,et al.Activiation human dendritic cells through CD40 cross-linking.Exp Med，1994,180（4）:1263-1272.
［6］ 张锦堃,陈慎仁.树突状细胞与肿瘤免疫治疗.汕头大学出版社，2001：29-30.
［7］ Welte T,Koch F,Schuler G,et al.Granulocyte-macroophage colony stimulating factor induces a unique set of STAT factor in murine dendritic cells.Eur J Immunol,2003,27（10）:2723-2740.
【关键词】 树突状细胞； 脐血 CD34+>/sup>细胞； rhGM-CSF； rhTNF-α； 体外培养
Induction and amplification of dendritic cells derived from human cord blood CD34+>/sup> cells in vitro CHEN Dong-xiao,ZHU Yuan-feng,WU Lin.The Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515041,China
【Abstract】 Objective The proliferation of human dendritic cells （DCs） from cord blood CD34+>/sup> cells induced by rhGM-CSF、rhTNF-α was observed.Methods CD34+>/sup> hematopoietic stem cells were isolated from healthy human cord blood using CD34+>/sup> progenitor cell isolated kit by a high-gradient magnetic cells sorting system（MACS）.The CD34+>/sup> cells were expanded with rhGM-CSF and rhTNF-α for 2 weeks. CD83 was analysed by means of flowcytometry.Results About 1.1×106>/sup> CD34+>/sup> cells were cultured, expanded and isolated from 50 ml cord blood:CD34+>/sup> stem cells were cultured in the presence of rhGM-CSF and rhTNF-α,and the cells were expanded 10～20-fold after 2 weeks. In the culture system,the small colony occur in the 3rd day,when expanded,the colony augment gradually and achieve the largest in the 8th to 9th day.About 81.7% expanded cells expessed CD83.Conclusion The in vitro culture system with rhGM-CSF and rhTNF-αcan effectively induce cord blood CD34+>/sup> cells to differentiate into dendritic cells.
【Key words】 Dendritic cell； Cord blood； CD34+>/sup>cell； rhGM-CSF； rhTNF-α； Cell culture in vitro
树突状细胞（dendritic cell，DC）是体内功能最强的一类专职性抗原递呈细胞，同时也是唯一能直接激活初始型T细胞的抗原递呈细胞，能通过MHC-Ⅰ将抗原递呈给CD8+细胞，激活细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL），从而发挥特异性杀伤作用［1］。无论是在机体免疫机制的研究还是应用于免疫治疗,DCs一直是研究的热点,特别是在肿瘤免疫中的地位越来越引起重视［2，3］。采用外周血单个核细胞体外诱导分化的方法培养DCs最终收获的DCs数量较少且活力和纯度都不高。而脐血来源广泛，取材方便，移植要求的HLA相合位点低，通过脐血CD34+>/sup>细胞分离扩增DC，有很大的实用价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 脐血 新鲜脐血50 ml,来源于汕头大学医学院第二附属医院健康产妇脐静脉血，经肝素（20 U/ml）抗凝。
1.1.2 主要试剂 Min-MACS磁式细胞分选器及CD34+>/sup>细胞分离试剂盒，CD34＋细胞分离盒包括试剂A：非特异性抗体阻断剂；试剂B：CD34+>/sup>磁珠单抗（Miltenyi Biotec公司）、rhGM-CSF（Sigma公司）、rhTNF-α（PePRO Tech Ec LTD）、FITC-CD83 micron-Ab1、FITC-mouse antihuman IGG1（e Bio Science公司）。淋巴细胞分离液及胎牛血清（天津TBD公司），DMEM/F12培养液（Gibico产品），BSA（Sigma公司）。
1.2 方法
1.2.1 脐血CD34+>/sup>细胞的分选 新鲜抗凝脐血经等量D-Hanks液稀释，再缓慢加于等量淋巴细胞分离液上，离心（2000 rpm，20 min，20 ℃），吸取白膜层细胞，分离出脐血单个核细胞。每108个单核细胞加入100 μl试剂A1，混匀后再加入100 μl试剂A2，6 ℃孵育30 min。采用Min-MACS磁式细胞分选器，经磁性细胞分离柱分选,收集CD34+>/sup>细胞,用台盼蓝染色并细胞计数。
1.2.2 CD34+>/sup>细胞诱导分化 将CD34+>/sup>干细胞悬浮于10% FBS DMEM+ F12培养液中，调整细胞浓度为1×105>/sup>/ml。每个培养瓶加入5 ml培养基，并加入细胞因子rhGM-CSF 200 ng/ml、rhTNF-α 100 ng/ml，在37 ℃、5% CO2 饱湿条件下培养14 d，培养过程中隔日或3.5 d保留换液并加相应细胞因子。2周后收集细胞行台盼蓝染色检测细胞活力并计数。
1.2.3 形态观察 培养过程中每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况、形态变化并拍照。
1.2.4 流式细胞仪检测树突状细胞CD83分子的表达 收集培养14 d的DC用冷Buffer（PH 7.2 PBS + 150 mM NaCl + 0.09% NaN3 + 0.2% BSA）悬浮为1×106>/sup>/ml，每管加入100 μl细胞悬液。每管加入20 μl FITC-CD83，对照管加20 μl FITC-IgG，4 ℃避光过夜。适量Buffer洗涤细胞。弃上清，加Buffer 1 ml,混匀。流式细胞仪 （FACS Calibur SE，美国BD公司）按说明上机检测。Winmdi 2.9软件分析结果。
1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行分析,所有数据均以x±s表示,
2 结果
2.1 细胞形态 50 ml脐带血可分离出CD34+>/sup>细胞（1.1±0.2）×106>/sup>，台盼蓝染色（95±1）%呈阴性。在细胞因子GM-CSF及TNF-α联合作用下，经14 d体外培养，CD34+>/sup>干细胞发育为成熟树突状细胞，扩增10～20倍。倒置显微镜下，CD34+>/sup>干细胞呈圆形，胞体小，在培养液中悬浮生长。在细胞因子作用下，CD34+>/sup>干细胞逐渐生长，第2天即可见部分细胞体积增大，但尚未见有集落生成。第3天开始，细胞开始形成集落，且细胞形态开始由圆形逐渐变成不规则形状。随着细胞的分裂增殖，细胞数量增多，集落逐渐变大，且在集落边缘呈毛刺状，周围可见有树突样突起的细胞。集落在第8～9 d最大，以后逐渐减小，散在悬浮细胞增多。随着细胞的逐渐成熟，大量的DC从集落中脱落，半悬浮生长于培养液中，其体积大小不一，形态多样，有的短而粗，有的细长，可见分支，表面呈毛刺状。典型的成熟DC呈星型或不规则状，有较多的树突状突起。培养体系中尚可见极少数的单核细胞和巨噬细胞。
2.2 成熟DC表面分子CD83表达 培养14 d的DC表面分子CD83用流式细胞仪检测，表达率为（81.7±1.2）%。
3 讨论
免疫磁珠技术是由20世纪70年代起步，80年代兴起的一种新技术，近年来在细胞分离纯化方面，特别是树突状细胞分离方面取得巨大的进展。本实验采用免疫磁珠法分离CD34+>/sup>细胞，简单方便，获得足够量的CD34+>/sup>细胞，且用CD34抗体标记的微磁珠并不影响CD34+>/sup>细胞的扩增和向DC方向分化，不影响DC的成熟与功能。
有实验［4］显示，不同的DC前体细胞增殖能力差异明显，诱生获得DC的时间和获取DC的效率也不一样。外周血单个核细胞来源的DC形成早，7～9 d即可分化成熟，但整个分化过程中细胞总量增生不明显。Caux等［5］发现，将脐血CD34+>/sup>细胞置于含有c-kit配体、GM-CSF和TNF-α的培养基中诱导5～7 d后，细胞分为CD14+>/sup>、c-fms+>/sup>、CD1a->/sup>和CD14->/sup>、c-fms->/sup>、CD1a+>/sup>两类细胞亚群。继续培养，前者可分化为巨噬细胞或者树突状细胞，后者先分化为具有郎格罕细胞特征的细胞；培养至12～14 d，再进一步分化为成熟的树突状细胞［6］。所以CD34+>/sup>细胞来源的DC形成晚，分化成熟需14 d，但分化过程中伴随细胞数量增殖。相同数量的脐血,后者扩增DC的效率明显高于前者。
笔者采用免疫磁珠法从脐血分离CD34+>/sup>细胞，纯度在95%以上，50 ml脐血分离出约1.1×106>/sup> 个CD34+>/sup>细胞，进行体外培养，在细胞因子作用下，发育为成熟的DC在80%以上，扩增量为10～20倍，足够于进一步的研究应用。
如果单独应用GM-CSF诱导，CD34+>/sup>前体细胞只能分化为粒细胞和巨噬细胞，而将GM-CSF与TNF-α联合应用，则可诱生出树突状细胞克隆。GM-CSF不但能诱导一系列特征性启动因子的表达以启动树突状细胞的分化［7］，而且能上调树突状细胞表达CD86，使成熟树突状细胞活化。而TNF-α对树突状细胞的成熟特别是在终末分化中有明显的促进作用。同时，TNF-α与GM-CSF联合应用可发挥两者的协同作用。TNF-α作为第一信号，上调树突状细胞前体的GM-CSF受体，使其达到一定的阈值，以接受GM-CSF的刺激，引导前体细胞向树突状细胞分化［6］。本实验联合应用TNF-α与GM-CSF诱导CD34+>/sup>细胞，第3天开始出现集落，第9天集落最大，以后集落变小，培养液中大部分为半悬浮细胞。培养14 d后，细胞发育为成熟的树突状细胞。
CD83被认为是树突状细胞充分成熟的标记，笔者对培养14 d的树突状细胞经流式细胞仪检测CD83分子，阳性率为81.7%，说明细胞在2周培养后，大部分分化发育成熟。
本实验结果表明,人脐血CD34+>/sup>干细胞在rhGM-CSF、rhTNF-α联合诱导下，经14 d扩增培养，分化发育为大量高纯度、形态功能成熟的DC，此方法简便可靠，有很大的实用价值，为树突状细胞的应用研究打下了坚实的基础。
参 考 文 献
［1］ Koopmann JO,Hammeiling GJ,Momburg F.Generation,intracellular tramsport and loading of peptides associated with MHC class Ⅰmolecules.Curr Opin Immunol,1997,9（1）:80-88.
［2］ HsuAK,KerrBM,JonesKL,et al.RNA loading of leukemic antigens into cord blood derived dendritic cells for immunotherapy.Biol Blood Marrow Transplant,2006,12（8）:855-867.
［3］ Guo G,Chen S,Zhang J,et al.Antitumor activity of a fusion of esophageal carcinoma cells with dendritic cells derived from cord blood.Vaccine,2005,23（45）:5225-5230.
［4］ 裴莉,陈洁平.人脐血不同前体细胞体外诱导分化为树突状细胞的研究.重庆医学,2004,33（6）:835-837.
［5］ Caux C,Massacrier C,Vanbervliet B,et al.Activiation human dendritic cells through CD40 cross-linking.Exp Med，1994,180（4）:1263-1272.
［6］ 张锦堃,陈慎仁.树突状细胞与肿瘤免疫治疗.汕头大学出版社，2001：29-30.
［7］ Welte T,Koch F,Schuler G,et al.Granulocyte-macroophage colony stimulating factor induces a unique set of STAT factor in murine dendritic cells.Eur J Immunol,2003,27（10）:2723-2740.