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摘要：试验设计了南美白对虾超氧岐化酶和酚氧化酶的荧光定量PCR检测的特异性引物，用于检测肝胰腺中超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）的表达。该方法避免了血清学检测免疫指标的不稳定性、测定值波动性较大的缺点，可作为评估南美白对虾免疫状态的一种分子检测方法。
关键词：南美白对虾；肝胰腺；SOD；PO；荧光定量PCR
中图分类号： S945.4 9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0290-02
南美白对虾属甲壳类动物，其免疫主要为非特异性免疫。包括体液免疫中的一些非特异性的酶或因子来进行的[1-2]。抗氧化酶是无脊椎动物机体非特异性免疫的一个重要方面，其中SOD是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为O2和H2O2的酶。超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化系统中起关键作用的酶，不仅具有清除体内自由基的作用，而且在机体免疫调节中具有重要的作用[3-4]。酚氧化酶（PO）是一种含铜的氧化还原酶，能够催化单酚羟化成二酚，再把二酚氧化成醌，醌在非酶促条件下形成反应终产物黑色素。其反应链的短暂中间产物拥有很高的生物毒性，能够抑制病原体胞外蛋白酶以及几丁质酶的活性，属于一种酶级联反应系统，在南美白对虾抵抗病原菌侵袭过程中具有重要作用[5-9]。
目前检测南美白对虾免疫活性因子通常是通过采集血清，采用生化反应方法检测免疫相关酶。由于采集过程及检测过程，酶活性极易受外界环境的影响，常导致检测结果波动性很大，检测的可靠性受影响。酶的产生是通过基因的转录、翻译及后加工形成的，其转录水平也可反映机体的免疫状态。虾肝胰腺是其血细胞产生的主要场所，肝胰腺组织免疫因子的转录表达也可作为评价机体免疫能力的指标之一。荧光定量PCR检测技术已经成为国际上检测基因表达通用的方法，能对低丰度mRNA水平进行定量分析[10]。设计特异性强的引物以及合适的反应条件是利用荧光定量PCR检测南美白对虾免疫相关因子的关键。本发明设计的引物及反应条件可同时用于检测南美白对虾肝胰腺SOD和PO的转录相对定量表达检测，为今后准确分析其南美白对虾免疫状态提供新的方法。
1材料与方法
1.1材料
南美白对虾来自浙江省绍兴县某养殖场，SYBGreen反应预混液购自Bio-Rad公司，M-MLV酶、dNTP、RNase抑制剂购自TaKaRa（大连）公司，Trizol购自Invotrigen公司。
1.2肝胰腺总 RNA的提取
取南美白对虾完整肝胰腺组织，加入500 μL Trizol裂解液，用研磨棒研磨，等彻底匀浆后，取50 μL匀浆液加入1 mL Trizol 继续裂解5 min。其余匀浆液置-80 ℃保存备用，或将完整肝胰腺在液氮中速冻后置于于-80 ℃下保存。使用时将组织全部碾磨后，取100 mg加入1 mL Trizol裂解，其余组织粉末置-80 ℃保存备用。
取出的50 μL匀浆液或100 mg组织粉末继续裂解5 min后，12 000 r/min条件下离心2 min，吸取上清至新的离心管。加入200 μL三氯甲烷，涡旋混匀，12 000 r/min条件下离心15 min，吸取上清。加入等体积异丙醇，颠倒混匀数次，静置10 min，12 000 r/min 条件下离心10 min，弃上清。用500 μL DEPC水配制的70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min 条件下离心 5 min，弃去上清。100 μL DEPC水溶解RNA。 测定RNA浓度和纯度后，-80 ℃保存备用。
1.3引物设计与合成
引物是根据GenBank公布的南美白对虾SOD（登录号：AY486424.1）、PO（登录号：JN393011.1）及β-actin内参基因序列（登录号：JF288784.1），由软件Primer Premier 5.0设计和手工修改后获得（表1），均由苏州金维智生物科技有限公司合成。
1.4cDNA合成
取1 μg 总RNA为模板，加入1 μL 10 mmol/L dNTP、1 μL 50 mmol/L Oligo（dT）15，加DEPC水至总体积6.25 μL，65 ℃变性5 min，冰上骤冷2 min。上述反应液加入2 μL 5× M-MLV buffer、0.25 μL RNA酶抑制剂、0.5 μL MMLV逆转录酶、1 μL 10 mmol/L二硫苏糖醇，使最终反应总体积达 10 μL。42 ℃反应1 h后，65 ℃孵育10 min，cDNA合成完毕。表1荧光定量PCR所用引物
检测基因名称引物序列（5′→3′）扩增长度（bp）SOD SOD-F：CGCCCTTGAACCTCACATCT；SOD-R：ATTGCGCTTACGTCATTGGC135POPO-F：AATGACCGCGTTGAGGAGTT；PO-R：AGTGGGATCTTCAGCTTGCC134β-actin（内参）β-actin-F：CGAGCGAGAAATCGTTCGTG；β-actin-R：GAATGAGGGCTGGAACAGGG187
合成的cDNA加入90 μL无菌双蒸水，用于后续荧光定量PCR扩增。1.5荧光定量的反应体系及条件
取5 μL上述合成的cDNA稀释液作为扩增模板，加入2×Sybgreen反应预混液12.5 μL，分别加入5 μmol/L相应特异性上、下游引物各0.5 μL，加6.5 μL无菌双蒸水，使反应总体系达25 μL，置于荧光定量PCR仪上进行PCR反应。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；60～90 ℃熔解曲线。
2结果与分析
2.1荧光定量PCR扩增效果 从扩增曲线可以看出，SOD、PO及内参基因β-actin的扩增曲线均较好，曲线拐点清楚，基线平，无上扬现象；SOD的CT值为23.85，PO的CT值为28.33，能较好地反映各基因的表达差异（图1）。通过CT值计算该样品中SOD和PO表达量相对于β-actin的表达量分别为0.140 63、0.006 30倍。
2.2荧光定量PCR扩增产物的熔解曲线
从扩增产物的熔解曲线看，SOD、PO及内参基因β-actin均为单峰，且峰值较高（图2），表明各扩增产物的特异性较好，且扩增效率较高。
2.3荧光定量PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测
将荧光定量PCR的扩增产物进行琼脂糖电泳检测，结果显示SOD、PO及内参基因β-actin的各扩增产物的条带单一，亮度较好，并能一定程度上看出各基因的表达差异（图3）。进一步证实了其较好的扩增效率和较高的扩增特异性。
3结论与讨论
非特异性免疫因子的测定是评估南美白对虾免疫状态的主要指标，建立可靠的检测方法对于南美白对虾的免疫学研究、抗病育种研究等都具有重要意义。传统的体液免疫指标的测定常采用酶法检测，但易受多种因素干扰，测定值偏差较大。近几年，随着分子生物学迅猛发展，荧光定量PCR方法开始被广泛应用于多种免疫因子定量检测[11-12]。荧光定量PCR检测方法的可靠性与所设计引物的特异性和扩增有效性密切相关。本方法针对SOD和PO等2个重要的非特异免疫指标设计了特异性较好、扩增效率较高的引物，建立了利用荧光定量PCR方法对南美白对虾肝胰腺SOD、PO的检测方法。该方法特异性强，敏感性高，克服了酶法测定易波动的问题，适合南美白对虾免疫活力的评估。
与酶法检测技术比较，本方法所提供的南美白对虾肝胰腺SOD、PO的荧光定量PCR检测方法具有以下优点：（1）所采用的肝胰腺组织较对虾血液采集更容易。（2）所采集的组织直接用Trizol处理或通过速冻方式保存，可有效减少RNA降解；较血清采集过程可能发生的溶血或其他导致酶失活的因素更易于控制，保证结果的可靠性。（3）设计的引物特异性好，扩增效率高，提高了检测的准确性。（4）采用相对定量方式，通过与内参基因表达量的对比，可同时测定多个免疫相关因子。
参考文献：
[1]黄辉洋，李少菁，王桂忠. 甲壳动物酚氧化酶活力及其在养殖中的应用[J]. 海洋通报，2000，19（3）：79-84.
[2]李光，樊景凤，林凤翱，等. 对虾的免疫机制及其疾病免疫预防的研究进展[J]. 水产科学，2007，26（1）：56-60.
[3]刘恒，李光友. 免疫多糖对养殖南美白对虾作用的研究[J]. 海洋与湖沼，1998，29（2）：113-118.
[4]丁美丽，林林，李光友，等. 有机污染对中国对虾体内外环境影响的研究[J]. 海洋与湖沼，1997，28（1）：7-12.
[5]王雷，李光友，毛远兴. 中国对虾血淋巴中的抗菌、溶菌活力与酚氧化酶活力的测定及其特性研究[J]. 海洋与湖沼，1995，26（2）：179-185.
[6]李天道，于佳，俞开康. 中国对虾血清中酚氧化酶活力研究[J]. 海洋湖沼通报，1998（1）：51-56.
[7]孟凡伦，张玉臻，孔健，等. 甲壳动物中的酚氧化酶原激活系统研究评价[J]. 海洋与湖沼，1999，30（1）：110-116.
[8]李桂英，宋晓玲，孙艳，等. 几株肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异免疫力和抗病力的影响[J]. 中国水产科学，2011，18（6）：1358-1367.
[9]胡毅，谭北平，麦康森，等. 饲料中益生菌对凡纳滨对虾生长、肠道菌群及部分免疫指标的影响[J]. 中国水产科学，2008，15（2）：244-251.
[10]王科，王晓雄，石炳毅. 实时荧光定量PCR在细胞因子mRNA检测研究中的应用[J]. 北京生物医学工程，2006，25（2）：217-221.
[11]Zokaeifar H，Balcázar J L，Saad C R，et al. Effects of Bacillus subtilis on the growth performance，digestive enzymes，immune gene expression and disease resistance of white shrimp，Litopenaeus vannamei[J]. Fish
关键词：南美白对虾；肝胰腺；SOD；PO；荧光定量PCR
中图分类号： S945.4 9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0290-02
南美白对虾属甲壳类动物，其免疫主要为非特异性免疫。包括体液免疫中的一些非特异性的酶或因子来进行的[1-2]。抗氧化酶是无脊椎动物机体非特异性免疫的一个重要方面，其中SOD是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为O2和H2O2的酶。超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化系统中起关键作用的酶，不仅具有清除体内自由基的作用，而且在机体免疫调节中具有重要的作用[3-4]。酚氧化酶（PO）是一种含铜的氧化还原酶，能够催化单酚羟化成二酚，再把二酚氧化成醌，醌在非酶促条件下形成反应终产物黑色素。其反应链的短暂中间产物拥有很高的生物毒性，能够抑制病原体胞外蛋白酶以及几丁质酶的活性，属于一种酶级联反应系统，在南美白对虾抵抗病原菌侵袭过程中具有重要作用[5-9]。
目前检测南美白对虾免疫活性因子通常是通过采集血清，采用生化反应方法检测免疫相关酶。由于采集过程及检测过程，酶活性极易受外界环境的影响，常导致检测结果波动性很大，检测的可靠性受影响。酶的产生是通过基因的转录、翻译及后加工形成的，其转录水平也可反映机体的免疫状态。虾肝胰腺是其血细胞产生的主要场所，肝胰腺组织免疫因子的转录表达也可作为评价机体免疫能力的指标之一。荧光定量PCR检测技术已经成为国际上检测基因表达通用的方法，能对低丰度mRNA水平进行定量分析[10]。设计特异性强的引物以及合适的反应条件是利用荧光定量PCR检测南美白对虾免疫相关因子的关键。本发明设计的引物及反应条件可同时用于检测南美白对虾肝胰腺SOD和PO的转录相对定量表达检测，为今后准确分析其南美白对虾免疫状态提供新的方法。
1材料与方法
1.1材料
南美白对虾来自浙江省绍兴县某养殖场，SYBGreen反应预混液购自Bio-Rad公司，M-MLV酶、dNTP、RNase抑制剂购自TaKaRa（大连）公司，Trizol购自Invotrigen公司。
1.2肝胰腺总 RNA的提取
取南美白对虾完整肝胰腺组织，加入500 μL Trizol裂解液，用研磨棒研磨，等彻底匀浆后，取50 μL匀浆液加入1 mL Trizol 继续裂解5 min。其余匀浆液置-80 ℃保存备用，或将完整肝胰腺在液氮中速冻后置于于-80 ℃下保存。使用时将组织全部碾磨后，取100 mg加入1 mL Trizol裂解，其余组织粉末置-80 ℃保存备用。
取出的50 μL匀浆液或100 mg组织粉末继续裂解5 min后，12 000 r/min条件下离心2 min，吸取上清至新的离心管。加入200 μL三氯甲烷，涡旋混匀，12 000 r/min条件下离心15 min，吸取上清。加入等体积异丙醇，颠倒混匀数次，静置10 min，12 000 r/min 条件下离心10 min，弃上清。用500 μL DEPC水配制的70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min 条件下离心 5 min，弃去上清。100 μL DEPC水溶解RNA。 测定RNA浓度和纯度后，-80 ℃保存备用。
1.3引物设计与合成
引物是根据GenBank公布的南美白对虾SOD（登录号：AY486424.1）、PO（登录号：JN393011.1）及β-actin内参基因序列（登录号：JF288784.1），由软件Primer Premier 5.0设计和手工修改后获得（表1），均由苏州金维智生物科技有限公司合成。
1.4cDNA合成
取1 μg 总RNA为模板，加入1 μL 10 mmol/L dNTP、1 μL 50 mmol/L Oligo（dT）15，加DEPC水至总体积6.25 μL，65 ℃变性5 min，冰上骤冷2 min。上述反应液加入2 μL 5× M-MLV buffer、0.25 μL RNA酶抑制剂、0.5 μL MMLV逆转录酶、1 μL 10 mmol/L二硫苏糖醇，使最终反应总体积达 10 μL。42 ℃反应1 h后，65 ℃孵育10 min，cDNA合成完毕。表1荧光定量PCR所用引物
检测基因名称引物序列（5′→3′）扩增长度（bp）SOD SOD-F：CGCCCTTGAACCTCACATCT；SOD-R：ATTGCGCTTACGTCATTGGC135POPO-F：AATGACCGCGTTGAGGAGTT；PO-R：AGTGGGATCTTCAGCTTGCC134β-actin（内参）β-actin-F：CGAGCGAGAAATCGTTCGTG；β-actin-R：GAATGAGGGCTGGAACAGGG187
合成的cDNA加入90 μL无菌双蒸水，用于后续荧光定量PCR扩增。1.5荧光定量的反应体系及条件
取5 μL上述合成的cDNA稀释液作为扩增模板，加入2×Sybgreen反应预混液12.5 μL，分别加入5 μmol/L相应特异性上、下游引物各0.5 μL，加6.5 μL无菌双蒸水，使反应总体系达25 μL，置于荧光定量PCR仪上进行PCR反应。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；60～90 ℃熔解曲线。
2结果与分析
2.1荧光定量PCR扩增效果 从扩增曲线可以看出，SOD、PO及内参基因β-actin的扩增曲线均较好，曲线拐点清楚，基线平，无上扬现象；SOD的CT值为23.85，PO的CT值为28.33，能较好地反映各基因的表达差异（图1）。通过CT值计算该样品中SOD和PO表达量相对于β-actin的表达量分别为0.140 63、0.006 30倍。
2.2荧光定量PCR扩增产物的熔解曲线
从扩增产物的熔解曲线看，SOD、PO及内参基因β-actin均为单峰，且峰值较高（图2），表明各扩增产物的特异性较好，且扩增效率较高。
2.3荧光定量PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测
将荧光定量PCR的扩增产物进行琼脂糖电泳检测，结果显示SOD、PO及内参基因β-actin的各扩增产物的条带单一，亮度较好，并能一定程度上看出各基因的表达差异（图3）。进一步证实了其较好的扩增效率和较高的扩增特异性。
3结论与讨论
非特异性免疫因子的测定是评估南美白对虾免疫状态的主要指标，建立可靠的检测方法对于南美白对虾的免疫学研究、抗病育种研究等都具有重要意义。传统的体液免疫指标的测定常采用酶法检测，但易受多种因素干扰，测定值偏差较大。近几年，随着分子生物学迅猛发展，荧光定量PCR方法开始被广泛应用于多种免疫因子定量检测[11-12]。荧光定量PCR检测方法的可靠性与所设计引物的特异性和扩增有效性密切相关。本方法针对SOD和PO等2个重要的非特异免疫指标设计了特异性较好、扩增效率较高的引物，建立了利用荧光定量PCR方法对南美白对虾肝胰腺SOD、PO的检测方法。该方法特异性强，敏感性高，克服了酶法测定易波动的问题，适合南美白对虾免疫活力的评估。
与酶法检测技术比较，本方法所提供的南美白对虾肝胰腺SOD、PO的荧光定量PCR检测方法具有以下优点：（1）所采用的肝胰腺组织较对虾血液采集更容易。（2）所采集的组织直接用Trizol处理或通过速冻方式保存，可有效减少RNA降解；较血清采集过程可能发生的溶血或其他导致酶失活的因素更易于控制，保证结果的可靠性。（3）设计的引物特异性好，扩增效率高，提高了检测的准确性。（4）采用相对定量方式，通过与内参基因表达量的对比，可同时测定多个免疫相关因子。
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[8]李桂英，宋晓玲，孙艳，等. 几株肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异免疫力和抗病力的影响[J]. 中国水产科学，2011，18（6）：1358-1367.
[9]胡毅，谭北平，麦康森，等. 饲料中益生菌对凡纳滨对虾生长、肠道菌群及部分免疫指标的影响[J]. 中国水产科学，2008，15（2）：244-251.
[10]王科，王晓雄，石炳毅. 实时荧光定量PCR在细胞因子mRNA检测研究中的应用[J]. 北京生物医学工程，2006，25（2）：217-221.
[11]Zokaeifar H，Balcázar J L，Saad C R，et al. Effects of Bacillus subtilis on the growth performance，digestive enzymes，immune gene expression and disease resistance of white shrimp，Litopenaeus vannamei[J]. Fish