了解转录因子ETS-1介导亚砷酸钠(NaAsO2)对人正常肝细胞L-02的微小RNA(miRNA,miR)-21表达的影响。
方法量-效关系研究:采用不同剂量NaAsO2[0.0(对照)、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L]作用L-02细胞24 h(n= 6)。时-效关系研究:采用0(对照)、20 μmol/L NaAsO2作用L-02细胞12、24、36、48 h(n= 6)。分别采用ETS-1短发夹RNA(shRNA)和miR-21 inhibitor对ETS-1和miR-21的表达进行干预。ETS-1 shRNA(100 nmol/L)处理分为4组:①ETS-1 shRNA对照(NC)处理组;②ETS-1 shRNA NC联合NaAsO2(20 μmol/L)处理组;③ETS-1 shRNA处理组;④ETS-1 shRNA联合NaAsO2(20 μmol/L)处理组。miR-21 inhibitor(100 nmol/L)处理分为4组:①miR-21 inhibitor NC处理组;②miR-21 inhibitor NC联合NaAsO2(20 μmol/L)处理组;③miR-21 inhibitor处理组;④miR-21 inhibitor联合NaAsO2(20 μmol/L)处理组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组L-02细胞ETS-1 mRNA、miR-21表达;蛋白免疫印迹法检测ETS-1蛋白表达。
结果量-效关系研究:0.0(对照)、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L组ETS-1 mRNA表达分别为1.008 ± 0.028、1.552 ± 0.029、1.697 ± 0.050、1.842 ± 0.077、2.233 ± 0.096、2.235 ± 0.092;miR-21表达分别为1.025 ± 0.094、1.552 ± 0.072、1.683 ± 0.066、1.915 ± 0.171、2.337 ± 0.195、2.592 ± 0.177;ETS-1蛋白表达分别为1.060 ± 0.045、1.267 ± 0.160、1.386 ± 0.087、1.723 ± 0.196、2.208 ± 0.122、2.284 ± 0.224,组间比较差异有统计学意义(F= 47.797、8.959、65.748,P均< 0.05),其中各染砷组均明显高于对照组(P均< 0.05),且呈剂量-效应关系。时-效关系研究:染砷L-02细胞12、24、36、48 h时ETS-1 mRNA表达分别为1.253 ± 0.175、1.623 ± 0.220、1.771 ± 0.324、1.913 ± 0.251;miR-21表达分别为1.502 ± 0.111、1.716 ± 0.113、1.979 ± 0.186、2.452 ± 0.304;ETS-1蛋白表达分别为1.196 ± 0.105、1.502 ± 0.076、1.651 ± 0.074、1.839 ± 0.139,组间比较差异有统计学意义(F= 14.936、39.180、39.441,P均< 0.05),其中各时间染砷组均明显高于相同时间点对照组(1.044 ± 0.115、1.044 ± 0.124、1.108 ± 0.088、1.053 ± 0.061;1.092 ± 0.061、1.096 ± 0.169、1.024 ± 0.111、1.057 ± 0.146;1.020 ± 0.017、1.049 ± 0.121、1.024 ± 0.089、1.031 ± 0.124,P均< 0.05),呈时间-效应关系。ETS-1 shRNA联合NaAsO2处理组与ETS-1 shRNA NC联合NaAsO2处理组比较,ETS-1 mRNA和miR-21表达明显下调(0.912 ± 0.238比1.641 ± 0.225,1.313 ± 0.334比2.363 ± 0.252,P均< 0.05);miR-21 inhibitor联合NaAsO2处理组与miR-21 inhibitor NC联合NaAsO2处理组比较,ETS-1 mRNA表达(1.580 ± 0.077比1.576 ± 0.065)差异无统计学意义(P > 0.05)。
结论L-02细胞中ETS-1、miR-21可应答NaAsO2暴露呈高表达状态,ETS-1介导了NaAsO2引起的miR-21高表达,可能是砷致人肝脏miRNAs表达改变及肝损伤的重要分子机制之一。