论文部分内容阅读
摘要：目的 建立HPLC同时测定六味地黄汤及方中山茱萸-牡丹皮药对莫诺苷、獐芽菜苷、芍药苷、马钱苷含量的方法，探讨全方与该药对主要药效成分之间的关联性。方法 采用Hypersil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为甲醇-水（24∶76），流速1.0 mL/min，检测波长236 nm，柱温30 ℃。结果 莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷分别在0.480～7.680 ?g（r=0.999 3）、0.103～1.650 ?g（r=0.999 5）、0.120～1.920 ?g（r=0.999 1）、0.227～3.630 ?g（r=0.999 7）范围内呈良好的线性关系，平均回收率分别为102.79%、102.29%、100.99%、102.48%，RSD分别为1.73%、1.48%、1.32%、0.75%。六味地黄汤中莫诺苷、獐芽菜苷、芍药苷含量略高于山茱萸-牡丹皮药对，马钱苷含量基本相同。结论 本方法简便可靠、重复性好，可用于六味地黄汤及山茱萸-牡丹皮药对苷类成分含量测定。山茱萸-牡丹皮药对含有六味地黄汤补肾作用的核心苷类成分。
关键词：六味地黄汤；山茱萸-牡丹皮药对；莫诺苷；獐芽菜苷；芍药苷；马钱苷；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.013
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）11-0057-05
Abstract： Objective To establish an HPLC method for the content determination of morroniside， sweroside， paeoniflorin and loganin of Liuwei Dihuang Decoction and its Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple； To discuss the relationship between the whole prescription and the couple of main pharmacodynamic components. Methods The HPLC method was used at Hypersile C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m）； the mobile phase consisted of methanol-water （24：76）； the detective wavelength was 236 nm； the flow rate was 1.0 mL/min； the column temperature was 30 ℃. Results The linear ranges of morroniside， sweroside， paeoniflorin and loganin were among 0.480–7.680 ?g （r=0.999 3）， 0.103–1.650 ?g （r=0.999 5）， 0.120–1.920 ?g （r=0.999 1） and 0.227–3.630 ?g （r=0.999 7）， respectively. The average recovery rates and RSD were 102.79%， 102.29%， 100.99%， 102.48%， and 1.73%， 1.48%， 1.32%， 0.75%， respectively. The contents of morroniside， sweroside and paeoniflorin in Liuwei Dihuang Decoction were slightly higher than that in Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple， and the contents of loganin were almost the same. Conclusion The method is simple， stable， accurate and reproducible. It can be used for content determinate of glycosides in Liuwei Dihuang Decoction and Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple. Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple has the glycosides with tonifying kidney effect of Liuwei Dihuang Decoction.
Keywords： Liuwei Dihuang Decoction； Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple； morroniside； sweroside； paeoniflorin； loganin； HPLC
六味地黃丸由钱乙在《小儿药证直诀》中首创，是金匮肾气丸减桂、附而成，由熟地黄、酒萸肉、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓6味药组成，是滋阴补肾的经典方，临床多用于肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、盗汗遗精、消渴等[1]。六味地黄汤主要含有莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷、芍药苷等苷类成分，熊果酸、没食子酸等有机酸类成分，以及丹皮酚等有效成分[2]。根据六味地黄汤相反相成的组方特点，该方可拆成3组补泻药对，即熟地黄-泽泻、山茱萸-牡丹皮、山药-茯苓。本课题组前期研究发现，六味地黄汤的3组补泻药对中，仅山茱萸-牡丹皮药对可通过调节神经内分泌系统下丘脑-垂体-肾上腺轴、下丘脑-垂体-甲状腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴中各激素水平来改善肾阴虚，可能是该方改善肾阴虚的主要药效组成部分[3-5]，而山茱萸-牡丹皮药对的主要有效成分及其含量、与六味地黄汤全方比较有何区别和联系，还需进一步研究。因此，本研究采用HPLC对六味地黄汤及山茱萸-牡丹皮药对中的苷类成分进行含量测定，建立HPLC同时测定莫诺苷、獐芽菜苷、芍药苷、马钱苷含量的方法，并探究全方与该药对中主要药效成分之间的关联性，为六味地黄汤药效物质基础和组方原理的研究提供依据。 1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱系统，安捷伦科技（中国）有限公司；Hypersile ODS2 C18色谱柱，大连依利特分析仪器有限公司）；SK5200H型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；JY3002型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。
莫諾苷对照品（批号140301）、獐牙菜苷对照品（批号111742-200501）、芍药苷对照品（批号110736- 200731）、马钱苷对照品（批号111640-201005），中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；重蒸水（实验室自制）。山药（批号CS15020203）、熟地黄（批号CS14120109）、茯苓（批号JC15051201）、酒萸肉（批号NG14122602）、牡丹皮（批号NG15030903）、盐泽泻（批号SH15040701）饮片，湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Hypersil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为甲醇-水（24∶76），检测波长为236 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 ?L[6]。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品适量，加甲醇分别制成浓度为960.00 ?g/mL莫诺苷对照品溶液、206.25 ?g/mL獐牙菜苷对照品溶液、240.00 ?g/mL芍药苷对照品溶液和453.75 ?g/mL马钱苷对照品溶液。
2.3 供试品溶液1的制备
按六味地黄汤处方中山茱萸-牡丹皮药对比例（4∶3）称取酒萸肉12 g、牡丹皮9 g，加6倍量水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，浓缩至1.5 g原药材/mL。再精密量取该水煎液2 mL，加入适量80%甲醇溶液，超声提取（功率200 W，频率53 kHz）30 min，过滤，转移至50 mL容量瓶中，再用80%甲醇定容至刻度，过0.45 ?m微孔滤膜，取续滤液，备用。
2.4 供试品溶液2的制备
按六味地黄汤处方称取熟地黄24 g、酒萸肉12 g、山药12 g、泽泻9 g、牡丹皮9 g、茯苓9 g，加6倍量水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，浓缩至1.5 g原药材/mL。再精密量取浓缩液5 mL，按“2.3”项下自“加入适量80%甲醇溶液”起方法制备，即得。
2.5 阴性对照溶液的制备
按六味地黄汤处方称取除山茱萸-牡丹皮药对外的其他饮片，加6倍量水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，浓缩至1.5 g原药材/mL。再精密量取浓缩液5 mL，按“2.3”项下自“加入适量80%甲醇溶液”起方法制备，即得。
2.6 专属性试验
取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷、马钱苷对照品溶液、供试品溶液1、供试品溶液2和阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果见图1～图4。
结果表明，供试品溶液1、2的色谱图中，在与莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液色谱图在相对应的保留时间处无色谱峰，表明阴性对照无干扰。
2.7 线性关系考察
精密量取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品溶液各0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL，分别置于5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得到不同浓度梯度的对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件，分别进样10 ?L，测定峰面积。以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线，得回归方程。莫诺苷：Y=5.075 1X+113.822 0，r=0.999 3；獐牙菜苷：Y=5.481 9X+42.856 2，r=0.999 5；芍药苷：Y=7.260 2X+49.248 7，r=0.999 1；马钱苷：Y=5.761 4X+15.189 2，r=0.999 7。结果表明，莫诺苷在0.480～7.680 ?g、獐芽菜苷在0.103～1.650 ?g、芍药苷在0.120～1.920 ?g、马钱苷在0.227～3.630 ?g范围内呈良好的线性关系。
2.8 精密度试验
精密量取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，各连续进样6次，测定峰面积，计算得RSD分别为1.08%、1.19%、1.18%和1.01%，结果表明仪器精密度良好。
2.9 重复性试验
取同一批山茱萸-牡丹皮药对饮片，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，并计算其含量。结果莫诺苷含量的平均值为0.776%，RSD=1.39%；獐牙菜苷含量的平均值为0.049%，RSD=1.95%；芍药苷含量的平均值为0.085%，RSD=1.11%；马钱苷含量的平均值为0.353%，RSD=1.35%。结果表明，本方法重复性良好。
2.10 稳定性试验
取同一供试品溶液，在室温条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷的峰面积，计算得RSD分别为1.18%、1.83%、1.14%和0.93%，结果表明，供试品溶液中莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷在24 h内稳定。
2.11 加样回收率试验
取已知莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷含量的山茱萸-牡丹皮药对供试品溶液，共6份，加入等同于供试品溶液中含量的4种对照品，按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算平均回收率，结果见表1～表4。 2.12 样品含量测定
按“2.3”“2.4”项下方法制备山茱萸-牡丹皮药对及六味地黄汤供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别测定莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷的含量，平行测定3次。按原药材量计算，得山茱萸-牡丹皮药对中莫诺苷含量为0.780%、獐牙菜苷含量为0.050%、芍药苷含量为0.097%、马钱苷含量为0.364%，见表5。按山茱萸-牡丹皮药对的原药材量计算，得六味地黄汤中莫诺苷含量为0.897%、獐牙菜苷含量为0.081%、芍药苷含量为0.104%、马钱苷含量为0.363%，见表6。
3 讨论
本试验分别对莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品溶液进行紫外扫描测定，结果莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷、马钱苷分别在242、247、230、236 nm波长处有最大吸收。再分别在这4个波长处对样品进行检测，选择基线平稳且所含有效组分指纹峰峰数适中的检测波长。结果发现，在236 nm波长条件下，样品色谱图基线稳定，出峰个数多且峰型较高，故最终确定检测波长为236 nm。
在选择流动相时，参照文献[7-8]和前期研究中的流动相条件加以调整、改进，结果发现，当甲醇与水的比例为24∶76时，各色谱峰保留时间适宜，且各成分分离效果较好。虽然莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷的出峰时间间隔较短，但山茱萸-牡丹皮药对和六味地黄汤在该流动相条件下各苷类成分色谱峰的分离度均大于1.5，且阴性对照色谱图中在与上述各成分相对应的保留时间处无干扰，故最终选用甲醇-水（24∶76）作为流动相。
本试验采用HPLC测定六味地黄汤及山茱萸-牡丹皮药对中莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷含量，该方法简单、快速、重复性好，可为六味地黄汤中山茱萸-牡丹皮药对的质量控制提供可靠的检测手段。
现代研究表明，六味地黄汤中苷类成分对T、B淋巴细胞有不同程度促增殖作用[9]，对生殖内分泌功能紊乱及免疫功能下降具有防治作用[10]，对培养的大鼠成骨细胞有促增殖作用[11]，可改善糖尿病肾阴虚证大鼠脂代谢[12]，并可能通过调节2型糖尿病大鼠脂肪组织PI3K/Akt信号通路来干预2型糖尿病胰岛素抵抗[13]；还有研究发现，六味地黄汤对氢化可的松致大鼠肾虚模型的保护作用，其中苷类成分中的獐芽菜苷、马钱苷、莫诺苷为该方补肾作用的核心成分[14]。2015年版《中华人民共和国药典》明确规定，马钱苷、莫诺苷为六味地黄丸含量测定的指标成分[15]，故六味地黄汤中苷类成分是该方补肾药效评价和质量控制的重要指标。本课题组前期研究发现，六味地黄汤中山茱萸-牡丹皮药对是该方改善肾阴虚证的主要药效组成部分[3-5]。本研究发现，山茱萸-牡丹皮药对中含有补肾作用的核心苷类成分（莫诺苷0.780%，獐牙菜苷0.050%，芍药苷0.097%，马钱苷0.364%）；但与山茱萸-牡丹皮药对比较，六味地黄汤中莫诺苷、獐芽菜苷、芍药苷的含量分别为0.897%、0.081%、0.104%，均略有增加，而马钱苷的含量变化不大（0.363%）。由此表明，六味地黄汤中除山茱萸-牡丹皮药对外的其他4味饮片，在煎煮过程中可影响该药对中苷类各成分的煎出量，从而影响六味地黄汤的药效，这可能是六味地黄汤全方补肾作用优于山茱萸-牡丹皮药对的原因之一。
参考文献：
[1] 徐小倩，朱谊，王晓华.六味地黄丸（汤）研究进展[J].哈尔滨医药， 2016，36（4）：484-486.
[2] 居玲玲.六味地黄汤的质量控制及有效成分的药代动力学研究[D].南京：南京中医药大学，2008.
[3] 肖子曾，杨梦琳，戴冰，等.六味地黄汤及“补泻”药对对肾阴虚模型小鼠HPA轴功能及肾上腺组织形态学的影响[J].湖南中医药大学学报， 2016，36（3）：17-20.
[4] 戴冰，楊梦琳，张嘉妮，等.六味地黄汤及其“一补一泻”药对对肾阴虚模型小鼠HPT轴的影响[J].中医药信息，2016，33（6）：19-22.
[5] 张嘉妮，李玉星，杨梦琳，等.六味地黄汤及“补泻”药对对肾阴虚模型小鼠下丘脑-垂体-性腺轴功能的影响[J].中国现代应用药学，2017， 34（1）：25-29.
[6] 吴沁璇.六味地黄汤水提醇溶部位对2型糖尿病模型大鼠肝脏PI3K/Akt信号通路的影响[D].长沙：湖南中医药大学，2015.
[7] 熊善丽，赵一民，栾新慧，等.RP-HPLC测定六味地黄方中苷类成分的含量[J].中国中药杂志.2003，28（8）：735-738.
[8] 蔡兴东，杨建平，黄春，等.高效液相色谱法测定川东獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量[J].中国医药导报，2011，8（5）：42-43.
[9] 刘继平，兰洲，傅强，等.六味地黄汤相关苷类单体对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的研究[J].中医药信息，2011，28（5）：49-52.
[10] 谢兴振，迟晓丽，周文霞，等.六味地黄苷糖对悬吊应激小鼠生殖内分泌及免疫系统的影响[J].中国科学：生命科学，2011，41（10）：986-991.
[11] 孙晖，张宁，李丽静，等.六味地黄丸主要血中移行成分对培养大鼠成骨细胞促增殖作用的研究[J].中国中药杂志，2008，33（17）：2161-2164.
[12] 肖子曾，邢瑞，戴冰，等.六味地黄汤及其水提醇沉物对2型糖尿病肾阴虚证大鼠脂代谢的影响[J].湖南中医药大学学报，2012，32（12）：17-18，22.
[13] 戴冰，吴沁璇，肖子曾，等.六味地黄汤及其水提醇溶部位对2型糖尿病模型大鼠脂肪组织中PI3K/Akt信号通路的影响[J].中成药，2016， 38（2）：428-430.
[14] 王喜军，张宁，孙晖，等.六味地黄丸血中移行成分对氢化可的松致大鼠肾虚动物模型的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2008，14（2）：33- 37.
[15] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：704-705.
关键词：六味地黄汤；山茱萸-牡丹皮药对；莫诺苷；獐芽菜苷；芍药苷；马钱苷；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.013
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）11-0057-05
Abstract： Objective To establish an HPLC method for the content determination of morroniside， sweroside， paeoniflorin and loganin of Liuwei Dihuang Decoction and its Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple； To discuss the relationship between the whole prescription and the couple of main pharmacodynamic components. Methods The HPLC method was used at Hypersile C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m）； the mobile phase consisted of methanol-water （24：76）； the detective wavelength was 236 nm； the flow rate was 1.0 mL/min； the column temperature was 30 ℃. Results The linear ranges of morroniside， sweroside， paeoniflorin and loganin were among 0.480–7.680 ?g （r=0.999 3）， 0.103–1.650 ?g （r=0.999 5）， 0.120–1.920 ?g （r=0.999 1） and 0.227–3.630 ?g （r=0.999 7）， respectively. The average recovery rates and RSD were 102.79%， 102.29%， 100.99%， 102.48%， and 1.73%， 1.48%， 1.32%， 0.75%， respectively. The contents of morroniside， sweroside and paeoniflorin in Liuwei Dihuang Decoction were slightly higher than that in Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple， and the contents of loganin were almost the same. Conclusion The method is simple， stable， accurate and reproducible. It can be used for content determinate of glycosides in Liuwei Dihuang Decoction and Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple. Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple has the glycosides with tonifying kidney effect of Liuwei Dihuang Decoction.
Keywords： Liuwei Dihuang Decoction； Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple； morroniside； sweroside； paeoniflorin； loganin； HPLC
六味地黃丸由钱乙在《小儿药证直诀》中首创，是金匮肾气丸减桂、附而成，由熟地黄、酒萸肉、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓6味药组成，是滋阴补肾的经典方，临床多用于肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、盗汗遗精、消渴等[1]。六味地黄汤主要含有莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷、芍药苷等苷类成分，熊果酸、没食子酸等有机酸类成分，以及丹皮酚等有效成分[2]。根据六味地黄汤相反相成的组方特点，该方可拆成3组补泻药对，即熟地黄-泽泻、山茱萸-牡丹皮、山药-茯苓。本课题组前期研究发现，六味地黄汤的3组补泻药对中，仅山茱萸-牡丹皮药对可通过调节神经内分泌系统下丘脑-垂体-肾上腺轴、下丘脑-垂体-甲状腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴中各激素水平来改善肾阴虚，可能是该方改善肾阴虚的主要药效组成部分[3-5]，而山茱萸-牡丹皮药对的主要有效成分及其含量、与六味地黄汤全方比较有何区别和联系，还需进一步研究。因此，本研究采用HPLC对六味地黄汤及山茱萸-牡丹皮药对中的苷类成分进行含量测定，建立HPLC同时测定莫诺苷、獐芽菜苷、芍药苷、马钱苷含量的方法，并探究全方与该药对中主要药效成分之间的关联性，为六味地黄汤药效物质基础和组方原理的研究提供依据。 1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱系统，安捷伦科技（中国）有限公司；Hypersile ODS2 C18色谱柱，大连依利特分析仪器有限公司）；SK5200H型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；JY3002型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。
莫諾苷对照品（批号140301）、獐牙菜苷对照品（批号111742-200501）、芍药苷对照品（批号110736- 200731）、马钱苷对照品（批号111640-201005），中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；重蒸水（实验室自制）。山药（批号CS15020203）、熟地黄（批号CS14120109）、茯苓（批号JC15051201）、酒萸肉（批号NG14122602）、牡丹皮（批号NG15030903）、盐泽泻（批号SH15040701）饮片，湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Hypersil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为甲醇-水（24∶76），检测波长为236 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 ?L[6]。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品适量，加甲醇分别制成浓度为960.00 ?g/mL莫诺苷对照品溶液、206.25 ?g/mL獐牙菜苷对照品溶液、240.00 ?g/mL芍药苷对照品溶液和453.75 ?g/mL马钱苷对照品溶液。
2.3 供试品溶液1的制备
按六味地黄汤处方中山茱萸-牡丹皮药对比例（4∶3）称取酒萸肉12 g、牡丹皮9 g，加6倍量水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，浓缩至1.5 g原药材/mL。再精密量取该水煎液2 mL，加入适量80%甲醇溶液，超声提取（功率200 W，频率53 kHz）30 min，过滤，转移至50 mL容量瓶中，再用80%甲醇定容至刻度，过0.45 ?m微孔滤膜，取续滤液，备用。
2.4 供试品溶液2的制备
按六味地黄汤处方称取熟地黄24 g、酒萸肉12 g、山药12 g、泽泻9 g、牡丹皮9 g、茯苓9 g，加6倍量水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，浓缩至1.5 g原药材/mL。再精密量取浓缩液5 mL，按“2.3”项下自“加入适量80%甲醇溶液”起方法制备，即得。
2.5 阴性对照溶液的制备
按六味地黄汤处方称取除山茱萸-牡丹皮药对外的其他饮片，加6倍量水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，浓缩至1.5 g原药材/mL。再精密量取浓缩液5 mL，按“2.3”项下自“加入适量80%甲醇溶液”起方法制备，即得。
2.6 专属性试验
取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷、马钱苷对照品溶液、供试品溶液1、供试品溶液2和阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果见图1～图4。
结果表明，供试品溶液1、2的色谱图中，在与莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液色谱图在相对应的保留时间处无色谱峰，表明阴性对照无干扰。
2.7 线性关系考察
精密量取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品溶液各0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL，分别置于5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得到不同浓度梯度的对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件，分别进样10 ?L，测定峰面积。以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线，得回归方程。莫诺苷：Y=5.075 1X+113.822 0，r=0.999 3；獐牙菜苷：Y=5.481 9X+42.856 2，r=0.999 5；芍药苷：Y=7.260 2X+49.248 7，r=0.999 1；马钱苷：Y=5.761 4X+15.189 2，r=0.999 7。结果表明，莫诺苷在0.480～7.680 ?g、獐芽菜苷在0.103～1.650 ?g、芍药苷在0.120～1.920 ?g、马钱苷在0.227～3.630 ?g范围内呈良好的线性关系。
2.8 精密度试验
精密量取莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，各连续进样6次，测定峰面积，计算得RSD分别为1.08%、1.19%、1.18%和1.01%，结果表明仪器精密度良好。
2.9 重复性试验
取同一批山茱萸-牡丹皮药对饮片，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，并计算其含量。结果莫诺苷含量的平均值为0.776%，RSD=1.39%；獐牙菜苷含量的平均值为0.049%，RSD=1.95%；芍药苷含量的平均值为0.085%，RSD=1.11%；马钱苷含量的平均值为0.353%，RSD=1.35%。结果表明，本方法重复性良好。
2.10 稳定性试验
取同一供试品溶液，在室温条件下，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷的峰面积，计算得RSD分别为1.18%、1.83%、1.14%和0.93%，结果表明，供试品溶液中莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷在24 h内稳定。
2.11 加样回收率试验
取已知莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷含量的山茱萸-牡丹皮药对供试品溶液，共6份，加入等同于供试品溶液中含量的4种对照品，按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算平均回收率，结果见表1～表4。 2.12 样品含量测定
按“2.3”“2.4”项下方法制备山茱萸-牡丹皮药对及六味地黄汤供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别测定莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷的含量，平行测定3次。按原药材量计算，得山茱萸-牡丹皮药对中莫诺苷含量为0.780%、獐牙菜苷含量为0.050%、芍药苷含量为0.097%、马钱苷含量为0.364%，见表5。按山茱萸-牡丹皮药对的原药材量计算，得六味地黄汤中莫诺苷含量为0.897%、獐牙菜苷含量为0.081%、芍药苷含量为0.104%、马钱苷含量为0.363%，见表6。
3 讨论
本试验分别对莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷对照品溶液进行紫外扫描测定，结果莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷、马钱苷分别在242、247、230、236 nm波长处有最大吸收。再分别在这4个波长处对样品进行检测，选择基线平稳且所含有效组分指纹峰峰数适中的检测波长。结果发现，在236 nm波长条件下，样品色谱图基线稳定，出峰个数多且峰型较高，故最终确定检测波长为236 nm。
在选择流动相时，参照文献[7-8]和前期研究中的流动相条件加以调整、改进，结果发现，当甲醇与水的比例为24∶76时，各色谱峰保留时间适宜，且各成分分离效果较好。虽然莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷的出峰时间间隔较短，但山茱萸-牡丹皮药对和六味地黄汤在该流动相条件下各苷类成分色谱峰的分离度均大于1.5，且阴性对照色谱图中在与上述各成分相对应的保留时间处无干扰，故最终选用甲醇-水（24∶76）作为流动相。
本试验采用HPLC测定六味地黄汤及山茱萸-牡丹皮药对中莫诺苷、獐牙菜苷、芍药苷和马钱苷含量，该方法简单、快速、重复性好，可为六味地黄汤中山茱萸-牡丹皮药对的质量控制提供可靠的检测手段。
现代研究表明，六味地黄汤中苷类成分对T、B淋巴细胞有不同程度促增殖作用[9]，对生殖内分泌功能紊乱及免疫功能下降具有防治作用[10]，对培养的大鼠成骨细胞有促增殖作用[11]，可改善糖尿病肾阴虚证大鼠脂代谢[12]，并可能通过调节2型糖尿病大鼠脂肪组织PI3K/Akt信号通路来干预2型糖尿病胰岛素抵抗[13]；还有研究发现，六味地黄汤对氢化可的松致大鼠肾虚模型的保护作用，其中苷类成分中的獐芽菜苷、马钱苷、莫诺苷为该方补肾作用的核心成分[14]。2015年版《中华人民共和国药典》明确规定，马钱苷、莫诺苷为六味地黄丸含量测定的指标成分[15]，故六味地黄汤中苷类成分是该方补肾药效评价和质量控制的重要指标。本课题组前期研究发现，六味地黄汤中山茱萸-牡丹皮药对是该方改善肾阴虚证的主要药效组成部分[3-5]。本研究发现，山茱萸-牡丹皮药对中含有补肾作用的核心苷类成分（莫诺苷0.780%，獐牙菜苷0.050%，芍药苷0.097%，马钱苷0.364%）；但与山茱萸-牡丹皮药对比较，六味地黄汤中莫诺苷、獐芽菜苷、芍药苷的含量分别为0.897%、0.081%、0.104%，均略有增加，而马钱苷的含量变化不大（0.363%）。由此表明，六味地黄汤中除山茱萸-牡丹皮药对外的其他4味饮片，在煎煮过程中可影响该药对中苷类各成分的煎出量，从而影响六味地黄汤的药效，这可能是六味地黄汤全方补肾作用优于山茱萸-牡丹皮药对的原因之一。
参考文献：
[1] 徐小倩，朱谊，王晓华.六味地黄丸（汤）研究进展[J].哈尔滨医药， 2016，36（4）：484-486.
[2] 居玲玲.六味地黄汤的质量控制及有效成分的药代动力学研究[D].南京：南京中医药大学，2008.
[3] 肖子曾，杨梦琳，戴冰，等.六味地黄汤及“补泻”药对对肾阴虚模型小鼠HPA轴功能及肾上腺组织形态学的影响[J].湖南中医药大学学报， 2016，36（3）：17-20.
[4] 戴冰，楊梦琳，张嘉妮，等.六味地黄汤及其“一补一泻”药对对肾阴虚模型小鼠HPT轴的影响[J].中医药信息，2016，33（6）：19-22.
[5] 张嘉妮，李玉星，杨梦琳，等.六味地黄汤及“补泻”药对对肾阴虚模型小鼠下丘脑-垂体-性腺轴功能的影响[J].中国现代应用药学，2017， 34（1）：25-29.
[6] 吴沁璇.六味地黄汤水提醇溶部位对2型糖尿病模型大鼠肝脏PI3K/Akt信号通路的影响[D].长沙：湖南中医药大学，2015.
[7] 熊善丽，赵一民，栾新慧，等.RP-HPLC测定六味地黄方中苷类成分的含量[J].中国中药杂志.2003，28（8）：735-738.
[8] 蔡兴东，杨建平，黄春，等.高效液相色谱法测定川东獐牙菜中獐牙菜苦苷的含量[J].中国医药导报，2011，8（5）：42-43.
[9] 刘继平，兰洲，傅强，等.六味地黄汤相关苷类单体对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的研究[J].中医药信息，2011，28（5）：49-52.
[10] 谢兴振，迟晓丽，周文霞，等.六味地黄苷糖对悬吊应激小鼠生殖内分泌及免疫系统的影响[J].中国科学：生命科学，2011，41（10）：986-991.
[11] 孙晖，张宁，李丽静，等.六味地黄丸主要血中移行成分对培养大鼠成骨细胞促增殖作用的研究[J].中国中药杂志，2008，33（17）：2161-2164.
[12] 肖子曾，邢瑞，戴冰，等.六味地黄汤及其水提醇沉物对2型糖尿病肾阴虚证大鼠脂代谢的影响[J].湖南中医药大学学报，2012，32（12）：17-18，22.
[13] 戴冰，吴沁璇，肖子曾，等.六味地黄汤及其水提醇溶部位对2型糖尿病模型大鼠脂肪组织中PI3K/Akt信号通路的影响[J].中成药，2016， 38（2）：428-430.
[14] 王喜军，张宁，孙晖，等.六味地黄丸血中移行成分对氢化可的松致大鼠肾虚动物模型的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2008，14（2）：33- 37.
[15] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：704-705.