【摘 要】
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目的 探讨含DEP结构域mTOR结合蛋白(DEPTOR)与人表皮生长因子受体2(ErbB2)的相互作用对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)增殖和成骨分化能力的影响.方法 收集联勤保障部队第九〇〇医院口腔科就诊的3例青少年患者正常人牙周膜组织,采用组织块培养方法分离hPDLSCs,并利用流式细胞术进行细胞鉴定.通过慢病毒将FLAG-DEP、FLAG-PDZ、FLAG-DEPTOR转染至P3代hPDLSCs,通过免疫共沉淀实验检测DEPTOR与ErbB2之间的结合关系.使用脂质体转染法将si-DEPTOR、si
【机 构】
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350025 福州,联勤保障部队第九〇〇医院口腔科
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目的 探讨含DEP结构域mTOR结合蛋白(DEPTOR)与人表皮生长因子受体2(ErbB2)的相互作用对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)增殖和成骨分化能力的影响.方法 收集联勤保障部队第九〇〇医院口腔科就诊的3例青少年患者正常人牙周膜组织,采用组织块培养方法分离hPDLSCs,并利用流式细胞术进行细胞鉴定.通过慢病毒将FLAG-DEP、FLAG-PDZ、FLAG-DEPTOR转染至P3代hPDLSCs,通过免疫共沉淀实验检测DEPTOR与ErbB2之间的结合关系.使用脂质体转染法将si-DEPTOR、si-ErbB2、si-NC转染至hPDLSCs,采用CCK8检测各组细胞的增殖能力;对细胞进行成骨诱导培养,采用茜素红染色观察细胞第21天成骨矿化形成情况,并用分光光度计法对矿化结节进行定量分析;利用RT-qPCR检测各组细胞Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)、1型胶原蛋白(COL1)、碱性磷酸酶(ALP)mRNA表达水平;采用Western blot检测各组细胞DEPTOR、Erb-b2受体酪氨酸激酶2(ErbB2)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)蛋白表达水平.多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验.结果 培养的P3代PDLSCs CD90和CD105表达呈阳性,CD34表达呈阴性.在过表达FLAG-DEPTOR和FLAG-DEP的免疫沉淀产物中可检测到ErbB2b蛋白.与si-NC比较,转染si-DEPTOR后DEPTOR蛋白表达水平(1.00±0.18比0.23±0.11)降低,差异有统计学意义(P?<0.05);与si-NC比较,转染si-ErbB2和si-DEPTOR后ErbB2蛋白表达水平(1.00±0.07比0.50±0.10、0.23±0.05)均降低,差异有统计学意义(P?<0.05).与si-NC比较,转染si-DEPTOR、si-ERB2的细胞在第7天增殖能力(246.45±8.66比208.33±2.89、216.67±5.77)减弱,矿化结节形成OD值(1.23±0.09比0.78±0.06、0.64±0.09)减少,Runx2、OCN、COL1、ALP mRNA表达水平、p-PI3K蛋白表达水平(1.00±0.16比0.36±0.05、0.16±0.06;1.00±0.27比0.38±0.08、0.21±0.12;1.00±0.15比0.51±0.07、0.51±0.09;1.00±0.17比0.70±0.03、0.64±0.08;1.00±0.15比0.44±0.05、0.23±0.05)降低.结论 在hPDLSCs中,DEPTOR的PDZ端与ErbB2结合.沉默DEPTOR能够降低其与ErbB2的相互作用,抑制PI3K信号通路,抑制细胞增殖和成骨分化.
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