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摘 要：为了探索新建立的一种多重PCR对动物源性食品检测的适用性，实验采用猪、牛、羊、鸡和鸭肉混合的方法，用多重PCR对混合肉样进行检测，以验证多重PCR的检测的可行性和有效性。通过对市售20种样品提取DNA进行多重PCR和单一PCR的5种动物源性成分检测结果比对，进一步比较两种方法检测结果的不同。结果表明，建立的多重PCR可同时检测出2种、3种、4种和5种动物源性成分，采用多重PCR法和单一PCR法对20种市售样品分别检测，两种方法结果无差异，表明所建立的多重PCR法可检测猪、牛、羊、鸡和鸭5种动物源性成分。
关键词：动物源性食品;多重PCR;单一PCR;适用性
应用PCR方法检测食品中动物源性成分的研究和标准有很多，目前已颁布的国家标准、行业标准和地方标准主要是基于常规定性PCR法和实时荧光PCR法对单一动物源性成分的定性检测。在实际工作中，对于动物源性成分不明确的加工制品，在需明确其成分时，需要通过不同的方法进行多次检测才能确定结果，其周期长、工作量大、成本高。在未来的动物源成分检测中，基于常规定性PCR法的检测技术已经越来越不能满足多种动物源性制品的鉴定需求，因此建立多重PCR法提高检测的效率与通量对肉类食品安全的及时监管十分重要[1]。本研究通过对新建立的一种检测动物源性食品中猪、牛、羊、鸡和鸭成分的多重PCR法进行混合肉样检测，验证其方法的适用性和可行性，并用建立的多重PCR检测方法和单一PCR检测方法对市售的20种动物源性食品分别进行检测，验证多重PCR法鉴别猪、牛、羊、鸡和鸭成分可行性。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
鲜肉（猪、牛、羊、鸭、鸡）购自南京某大型菜市场，-20 ℃保存。加工肉制品（鸭血、牛肉卷、鸡肉火腿肠、午餐肉罐头等）购自南京某菜市场、超市或火锅食材店。
DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0、10×PCR Buffer（Mg2+ plus）、dNTP Mixture（各2.5 mmol·L-1）、TaKaRa Taq（5 U/?L）、琼脂糖（50 g），均购于宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 仪器和设备
ABI 2720普通PCR仪，购自美国赛默飞;EPS 300电泳仪，购自Tanon;Universal GenoSens1800凝胶成像仪，购自上海勤翔。
1.3 实验方法
1.3.1 样本DNA提取及质量检测
样本DNA的提取方法按照DNA提取试剂盒的说明书方法步骤进行。样本DNA提取后取DNA溶液1 ?L，滴加到超微量紫外分光光度计中，测定DNA的质量浓度及纯度。DNA浓度控制在50～100 ng/?L，OD260nm/OD280nm值为1.8～2.1。
1.3.2 多重PCR方法检测混合样品
用所建立的方法对混合肉样进行PCR扩增，反应时加入2种、3种、4种、5种肉样的混合模板，按优化的引物浓度配比进行多重PCR检测，通过多次实验优化模板混合比例，以达到1个PCR反应和1次电泳可同时扩增出2～5条特异性条带，达到鉴别2～5种动物源性成分的目的。
1.3.3 市售动物源性食品检测
对从超市、菜市场和门店随机购买的20种肉制品，用建立的多重PCR检测方法和检测猪、牛、羊、鸡和鸭的行业标准[2-4]分别对猪、牛、羊、鸡和鸭5种成分进行检测，以检验建立的方法能否成功应用于市售肉类食品中的动物源性成分，进一步验证此方法的可行性。市售样品的DNA提取也同样按1.3.1的方法进行。
2 結果与分析
2.1 DNA质量浓度和纯度的检测结果
按照1.3.1对提取的样品DNA进行质量浓度及纯度测定，结果见表3。
由表1看出，用微量核酸蛋白测定分析仪检测提取的样品DNA的浓度和纯度，所测OD260nm/OD280nm值在1.8～2.1，有的DNA浓度提取的较高，需要对所提DNA的浓度进行适当稀释，从样品中提取的DNA无论是浓度还是纯度，均能满足后续PCR扩增实验的需求。
表1 DNA的质量浓度及纯度
名称 A260 A280 A260/A280 质量浓度/（ng/?L）
猪肉 0.215 0.106 2.02 169.9
牛肉 4.449 2.453 1.81 229.9
羊肉 0.345 0.167 2.06 150.7
鸡肉 0.204 0.098 2.08 110.3
鸭肉 0.342 0.187 1.82 196.5
2.2 混合肉样品检测结果
分别以猪、牛、羊、鸡和鸭2种、3种、4种及5种肉样混合为混合模板，用建立的多重PCR检测方法进行多重PCR检测。结果见图1和图2。
由图1可以看出，当猪和牛、猪和羊、猪和鸡、猪和鸭模板混合比例分别为1︰1、1︰1、1︰2、1︰2时，牛和羊、牛和鸡、牛和鸭模板混合比例分别为1︰1、1︰2、1︰2时，羊和鸡、羊和鸭、鸭和鸡模板混合比例分别为1︰2、1︰2、1︰1时，猪、牛和羊、猪、牛和鸡、猪、牛和鸭、猪、羊和鸡、猪、羊和鸭、猪、鸡和鸭、牛、羊和鸡、牛、羊和鸭、牛、鸡和鸭、羊、鸡和鸭模板混合比例分别为1︰1︰1、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰2︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰2︰2、1︰2︰2时，能分别同时扩增出牛274 bp，羊331 bp，398 bp，鸡227 bp，鸭201 bp 2条或3条特异性条带。
由图2可以看出，当猪、羊、牛和鸡、猪、羊、牛和鸭、猪、牛、鸡和鸭、猪、羊、鸡和鸭、牛、羊、鸡和鸭模板混合比例分别为1︰1︰1︰2、1︰1︰1︰2、1︰1︰2︰2、1︰1︰2︰2、1︰1︰2︰2时，猪、牛、羊、鸡和鸭模板混合比例1︰1︰1︰2︰2时，能分别同时扩增出牛274 bp，羊331 bp，398 bp，鸡227 bp，鸭201 bp 4条或5条特异性条带。以上的电泳条带清晰，亮度基本一样，能分别有效鉴别出2种、3种、4种或5种动物源性成分。
2.3 市售肉制品检测结果
对市售的20种肉制品进行DNA提取，应用建立的多重PCR方法和单一PCR分别进行检测，判断所检测成分与所贴标签是否相符，同时验证所建立方法的可行性和实用性。扩增结果见表2。
由表2看出，应用建立的五重PCR方法与用单一PCR对市售的20种肉制品分别进行猪、牛、羊、鸡和鸭成分进行检测，由检测结果对比可以看出，两种方法检测出的动物源性成分结果一致。使用混合引物对上述5种成分进行检测，检测结果能够扩增出来相应的多种肉的特异性条带，该检测方法能够准确地鉴定出所建立方法的5种常见动物成分，对于经过加工的肉制品，方法扩增出来的条带依然很清晰有效。本研究所鉴定的产品大多数与标签标识成分相符，但也存在造假和掺假的问题，所购买的样品掺假和造假率为25%。
3 讨论
本研究建立的多重PCR法可满足一次PCR反应和一次电泳就能分别有效鉴别出2种、3种、4种或5种动物源性成分，大大地减少了试剂和时间成本。为验证所建立方法的可行性和准确性，对市售的20种肉制品应用所建立的五重PCR和单一PCR对样品分别进行猪、牛、羊、鸡和鸭成分的检测，检测结果表明所建立的方法与单一PCR检测结果一致。表明所建立的多重PCR法可同时检测猪、牛、羊、鸡和鸭5种动物源性成分。本研究与王金斌等[1]研究的5种动物源性成分多重PCR检测方法相比，开发的方法引物数量少3条，与其相比，本研究使用的试剂更少，更加节约时间和成本。
参考文献
[1]王金斌，白蓝，李文，等.同步检测动物源性成分的五重PCR的条件优化和检出限分析[J].核农学报，2018，32（3）：506-514.
[2]国家食品药品监督管理总局.SN/T 2051—2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法[S].北京：中国标准出版社，2008.
[3]国家食品药品监督管理总局.SN/T 2978—2011动物源性产品中鸡源性成分PCR检测方法[S].北京：中国标准出版社，2012.
[4]国家食品药品监督管理总局.SN/T 3731.5—2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第5部分：鸭成分检测PCR法[S].北京：中国标准出版社，2014.
关键词：动物源性食品;多重PCR;单一PCR;适用性
应用PCR方法检测食品中动物源性成分的研究和标准有很多，目前已颁布的国家标准、行业标准和地方标准主要是基于常规定性PCR法和实时荧光PCR法对单一动物源性成分的定性检测。在实际工作中，对于动物源性成分不明确的加工制品，在需明确其成分时，需要通过不同的方法进行多次检测才能确定结果，其周期长、工作量大、成本高。在未来的动物源成分检测中，基于常规定性PCR法的检测技术已经越来越不能满足多种动物源性制品的鉴定需求，因此建立多重PCR法提高检测的效率与通量对肉类食品安全的及时监管十分重要[1]。本研究通过对新建立的一种检测动物源性食品中猪、牛、羊、鸡和鸭成分的多重PCR法进行混合肉样检测，验证其方法的适用性和可行性，并用建立的多重PCR检测方法和单一PCR检测方法对市售的20种动物源性食品分别进行检测，验证多重PCR法鉴别猪、牛、羊、鸡和鸭成分可行性。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
鲜肉（猪、牛、羊、鸭、鸡）购自南京某大型菜市场，-20 ℃保存。加工肉制品（鸭血、牛肉卷、鸡肉火腿肠、午餐肉罐头等）购自南京某菜市场、超市或火锅食材店。
DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0、10×PCR Buffer（Mg2+ plus）、dNTP Mixture（各2.5 mmol·L-1）、TaKaRa Taq（5 U/?L）、琼脂糖（50 g），均购于宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 仪器和设备
ABI 2720普通PCR仪，购自美国赛默飞;EPS 300电泳仪，购自Tanon;Universal GenoSens1800凝胶成像仪，购自上海勤翔。
1.3 实验方法
1.3.1 样本DNA提取及质量检测
样本DNA的提取方法按照DNA提取试剂盒的说明书方法步骤进行。样本DNA提取后取DNA溶液1 ?L，滴加到超微量紫外分光光度计中，测定DNA的质量浓度及纯度。DNA浓度控制在50～100 ng/?L，OD260nm/OD280nm值为1.8～2.1。
1.3.2 多重PCR方法检测混合样品
用所建立的方法对混合肉样进行PCR扩增，反应时加入2种、3种、4种、5种肉样的混合模板，按优化的引物浓度配比进行多重PCR检测，通过多次实验优化模板混合比例，以达到1个PCR反应和1次电泳可同时扩增出2～5条特异性条带，达到鉴别2～5种动物源性成分的目的。
1.3.3 市售动物源性食品检测
对从超市、菜市场和门店随机购买的20种肉制品，用建立的多重PCR检测方法和检测猪、牛、羊、鸡和鸭的行业标准[2-4]分别对猪、牛、羊、鸡和鸭5种成分进行检测，以检验建立的方法能否成功应用于市售肉类食品中的动物源性成分，进一步验证此方法的可行性。市售样品的DNA提取也同样按1.3.1的方法进行。
2 結果与分析
2.1 DNA质量浓度和纯度的检测结果
按照1.3.1对提取的样品DNA进行质量浓度及纯度测定，结果见表3。
由表1看出，用微量核酸蛋白测定分析仪检测提取的样品DNA的浓度和纯度，所测OD260nm/OD280nm值在1.8～2.1，有的DNA浓度提取的较高，需要对所提DNA的浓度进行适当稀释，从样品中提取的DNA无论是浓度还是纯度，均能满足后续PCR扩增实验的需求。
表1 DNA的质量浓度及纯度
名称 A260 A280 A260/A280 质量浓度/（ng/?L）
猪肉 0.215 0.106 2.02 169.9
牛肉 4.449 2.453 1.81 229.9
羊肉 0.345 0.167 2.06 150.7
鸡肉 0.204 0.098 2.08 110.3
鸭肉 0.342 0.187 1.82 196.5
2.2 混合肉样品检测结果
分别以猪、牛、羊、鸡和鸭2种、3种、4种及5种肉样混合为混合模板，用建立的多重PCR检测方法进行多重PCR检测。结果见图1和图2。
由图1可以看出，当猪和牛、猪和羊、猪和鸡、猪和鸭模板混合比例分别为1︰1、1︰1、1︰2、1︰2时，牛和羊、牛和鸡、牛和鸭模板混合比例分别为1︰1、1︰2、1︰2时，羊和鸡、羊和鸭、鸭和鸡模板混合比例分别为1︰2、1︰2、1︰1时，猪、牛和羊、猪、牛和鸡、猪、牛和鸭、猪、羊和鸡、猪、羊和鸭、猪、鸡和鸭、牛、羊和鸡、牛、羊和鸭、牛、鸡和鸭、羊、鸡和鸭模板混合比例分别为1︰1︰1、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰2︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰2︰2、1︰2︰2时，能分别同时扩增出牛274 bp，羊331 bp，398 bp，鸡227 bp，鸭201 bp 2条或3条特异性条带。
由图2可以看出，当猪、羊、牛和鸡、猪、羊、牛和鸭、猪、牛、鸡和鸭、猪、羊、鸡和鸭、牛、羊、鸡和鸭模板混合比例分别为1︰1︰1︰2、1︰1︰1︰2、1︰1︰2︰2、1︰1︰2︰2、1︰1︰2︰2时，猪、牛、羊、鸡和鸭模板混合比例1︰1︰1︰2︰2时，能分别同时扩增出牛274 bp，羊331 bp，398 bp，鸡227 bp，鸭201 bp 4条或5条特异性条带。以上的电泳条带清晰，亮度基本一样，能分别有效鉴别出2种、3种、4种或5种动物源性成分。
2.3 市售肉制品检测结果
对市售的20种肉制品进行DNA提取，应用建立的多重PCR方法和单一PCR分别进行检测，判断所检测成分与所贴标签是否相符，同时验证所建立方法的可行性和实用性。扩增结果见表2。
由表2看出，应用建立的五重PCR方法与用单一PCR对市售的20种肉制品分别进行猪、牛、羊、鸡和鸭成分进行检测，由检测结果对比可以看出，两种方法检测出的动物源性成分结果一致。使用混合引物对上述5种成分进行检测，检测结果能够扩增出来相应的多种肉的特异性条带，该检测方法能够准确地鉴定出所建立方法的5种常见动物成分，对于经过加工的肉制品，方法扩增出来的条带依然很清晰有效。本研究所鉴定的产品大多数与标签标识成分相符，但也存在造假和掺假的问题，所购买的样品掺假和造假率为25%。
3 讨论
本研究建立的多重PCR法可满足一次PCR反应和一次电泳就能分别有效鉴别出2种、3种、4种或5种动物源性成分，大大地减少了试剂和时间成本。为验证所建立方法的可行性和准确性，对市售的20种肉制品应用所建立的五重PCR和单一PCR对样品分别进行猪、牛、羊、鸡和鸭成分的检测，检测结果表明所建立的方法与单一PCR检测结果一致。表明所建立的多重PCR法可同时检测猪、牛、羊、鸡和鸭5种动物源性成分。本研究与王金斌等[1]研究的5种动物源性成分多重PCR检测方法相比，开发的方法引物数量少3条，与其相比，本研究使用的试剂更少，更加节约时间和成本。
参考文献
[1]王金斌，白蓝，李文，等.同步检测动物源性成分的五重PCR的条件优化和检出限分析[J].核农学报，2018，32（3）：506-514.
[2]国家食品药品监督管理总局.SN/T 2051—2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法[S].北京：中国标准出版社，2008.
[3]国家食品药品监督管理总局.SN/T 2978—2011动物源性产品中鸡源性成分PCR检测方法[S].北京：中国标准出版社，2012.
[4]国家食品药品监督管理总局.SN/T 3731.5—2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第5部分：鸭成分检测PCR法[S].北京：中国标准出版社，2014.