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摘 要：为了明确生物有机肥处理方式与微生物菌群之间的相互关系，利用添加了生物有机肥发酵菌剂的高温堆肥体系，采用生产试验和平板稀释法，调查了不同C/N、不同通风方式以及不同物料水分对有机肥发酵过程中几种常见菌群数量动态变化的影响。结果表明，在C/N为25：1，翻堆3次，初始水分65%，以后不再增加水分的条件下，有机肥发酵过程中真菌以及细菌的生长与繁殖增加，霉菌数量受到抑制。本试验将为生物有机肥发酵腐熟标准体系的建立提供参考依据。
关键词：处理方式，生物有机肥，微生物菌群
中图分类号：S572.06 文章编号：1007-5119（2014）05-0033-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.05.007
生态农业的生产需要土壤提供作物生长的营养物质和生存环境，施用生物有机肥可以改善土壤微生物的生长环境，同时也是土壤微生物取得能量和养分的主要来源[1]。施用有机肥一方面可提高土壤的微生物量，以使更多的养分固持在微生物体内免遭流失，从而使土壤保持较高的肥力水平；另一方面还可加速土壤微生物量的周转，死亡的微生物经矿化后能释放出更多的养分供作物吸收。
生物有机肥是多种有益微生物菌群与有机肥结合形成的新型、高效、安全的微生物有机复合肥料[2-7]。而有机肥的发酵是一个生物学过程，在这一过程中，涉及的微生物数目巨大，种类繁多，不同的微生物可利用不同的碳源，每一类微生物都需要适合自身生长繁殖的环境条件，并且对某一种或某一类特定的有机物的分解起作用。目前，有机肥发酵过程中参与的微生物主要有：细菌、放线菌和真
基金项目：贵州省烟草公司遵义市公司科技项目（2011-10）
作者简介：叶江平，男，农艺师，主要从事烟叶生产技术和管理工作。E-mail：superpowerqyx@163.com。*通信作者，E-mail：dingting98@126.com
收稿日期：2013-05-30 修回日期：2013-11-12
菌（包括霉菌和酵母菌）。随着发酵过程中温度和pH等环境条件以及C/N、通风方式、物料水分等处理方式的变化，微生物种群数量也会发生变化，在不同的发酵阶段形成各异的优势菌群，从而对不同的有机物进行分解消化[8-12]。
有机肥的发酵过程是一个复杂的过程，要达到良好的堆制效果，必须控制一些主要影响因素，如碳氮比（C/N）、通风方式、物料水分、温度和pH等。这些因素决定了微生物的活动强度，从而影响堆肥在发酵过程中的速度与品质。本研究比较不同C/N、不同通风方式以及不同物料水分对加入发酵菌剂的有机肥发酵过程中几种常见菌群数量的动态变化，旨在为生物有机肥发酵腐熟标准体系的建立提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 生物菌剂
众和有机物料腐熟剂（青岛天地缘生物技术开发有限公司）为生物有机肥发酵剂，是一种复合微生物菌剂，主要含有枯草芽孢杆菌、黑曲霉及米曲霉等微生物类群。前期试验检测发现，菌剂中含有真菌和细菌分别为0.96×106和0.45×106个/g。
1.2 培养基
PDA培养基（分离真菌用）：马铃薯200 g，琼脂15 g，葡萄糖20 g，水1000 mL。
NA培养基（分离细菌用）：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂15～20 g，水1000 mL，pH 7.2～7.5。
马丁氏（Martin）培养基（分离霉菌用）：葡萄糖10.0 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g，蛋白胨5.0 g，1%孟加拉红水溶液（rose bengal，玫瑰红水溶液）3.3 mL，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，氯霉素。
1.3 试验设计
试验于2011年12月中旬至2012年3月中旬在贵州省遵义市正安县谢坝乡有机肥研发工场进行。采用条垛型有氧发酵方式堆积，在条垛底部中间设宽度20 cm、深度10 cm的通风槽，堆垛下宽约180 cm，上宽约90 cm，高度约90 cm，长度根据物料量确定。
试验材料为玉米秸秆和牛粪，按体积将玉米秸秆和牛粪分层堆积，在底层铺一层玉米秸秆后，再铺一层牛粪，在玉米秸秆和牛粪之间洒上发酵菌剂（青岛天地缘生物技术开发有限公司生产，众和有机物料腐熟剂，用量为200 g/t湿物料），共分5层堆积，堆积后盖塑料膜防雨保温。
1.3.1 不同C/N试验 试验为C/N单因素4水平完全随机设计，3次重复，C：N水平分别为20：1、25：1、30：1和35：1。玉米秸秆和牛粪用量（干质量）见表1，玉米秸秆含C量为46.31%、含N量为0.53%，牛粪（风干）含C量为34.16%、含N量为1.78%，用尿素补足物料含N量。翻堆3次进行通风，第1次翻堆在降温期（温度低于50 ℃时）进行，以后每隔15 d进行第2次和第3次翻堆。第1次翻堆补足水分65%，以后不再补充水分。
1.3.2 通风方式试验 试验为通风方式单因素3水平完全随机设计，3次重复，处理水平分别为（1）翻堆3次+不通风；（2）翻堆3次+间歇式通风；（3）不翻堆+间歇式强制通风（保证堆中心含氧量不小于10%）。所有处理C/N均为25：1，间歇式通风为在通风槽进风口安装150 W鼓风机，通过继电器控制鼓风机，鼓风机工作0.5 h，停止1 h，循环往复。
1.3.3 物料水分试验 试验为单因素3水平完全随机设计，3次重复，处理水平分别为（1）初始水分65%，以后不再增加水分，该处理简称初始水分65%；（2）初始水分55%，第1次翻堆补足水分至65%，以后不再增加水分，简称初始水分55%；（3）初始水分75%，以后不再增加水分，简称初始水分 65%。所有处理C：N均为25：1，初始水分调控采用105 ℃温度烘8 h检测试验用玉米秸秆和牛粪含水率（质量比），通过计算各层玉米秸秆和牛粪用量，采用喷水的方法将各处理调控到初始含水率（质量比），处理（2）第1次翻堆补足水分也是先取样检测物料含水率，并测量堆体体积和物料容重，计算需要补充水分量，在第1次翻堆时采用喷水的方法补足水分。
1.4 取样方法
分别于第1、2、3次翻堆和最后成品装袋时共分4次，从堆垛前中后（按条垛长度从中间和距两端1/4处垂直挖开剖面）和上中下（按条垛高度从中间和距上下端1/4处水平位置各取样0.5 kg）取样拌匀后，用四分法取样2份，每份0.5 kg。
1.5 堆肥样品可培养微生物计数
不同处理的堆体中真菌总数、细菌总数和霉菌总数的测定采用稀释平板测数法[13]，混菌接种培养。细菌培养24 h后计数，真菌、霉菌培养72 h后计数。以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，统计有效活菌数目。
2 结 果
2.1 碳氮比对发酵过程中微生物数量的影响
2.1.1 真菌数量 由表2可看出，所有C：N处理水平真菌数量随取样时间的推后呈下降趋势，且随着有机肥发酵的结束，C：N=25：1处理最终检测到的真菌数量远大于C：N=35：1处理，此可能是因为C：N=25：1和C：N=35：1两处理的碳氮在有机肥发酵的前期能较好地满足真菌的生长繁殖，避免了发酵
ganic manure
注：同列内小写字母不同表示5%显著差异，下同。
过程中真菌菌体的衰老以及自溶；而随着发酵的进行，C：N=25：1处理发酵堆体的氧浓度含量大于C：N=35：1处理组（数显氧浓度探测器测定），可能导致有机肥发酵结束，C：N=25：1处理组的真菌数量大于C：N=35：1处理组。
2.1.2 细菌数量 由表3可以看出，除C：N=20：1处理外，其余3个处理4次取样分离到的细菌数量变化总体趋势均为先下降后上升，而C：N=20：1处理4次取样分离到的细菌数量变化总体趋势则为先上升后下降。其中，25：1处理4次取样分离到的细菌数量均较多（仅第3次取样分离的细菌数量少于35：1处理），且发酵末期即第4次取样分离到的细菌数量有明显的上升。究其原因，可能是该处理的碳氮比有利于堆肥中的细菌生长和繁殖，菌群生长较为旺盛，到发酵末期，由于外界温度条件等环境因素的影响，细菌进入了2次生长，导致发酵末期分离到的细菌数量有显著回升。
2.1.3 霉菌数量 由表4可知，所有处理4次取样分离到的霉菌数量变化总体趋势均为依次下降。相对其他处理来说，25：1处理发酵过程中分离到的数量相对较少，且第4次取样时25：1处理分离到的霉菌数量仅为60个/g。
Table 4 Effect of C/N on mould community of the bio-organic manure
2.2 通风方式对发酵过程中微生物数量的影响
2.2.1 真菌数量 由表5可知，所有3个处理真菌数量变化总体均呈下降趋势，其中，不翻堆+间歇式强制通风处理分离到的真菌数量最少，而其余两个处理4次取样分离到的真菌数量相对较多。究其原因，可能是翻堆处理有利于有机肥中真菌的生长和繁殖，翻堆可以破碎结块的物料，使物料分布均匀，从而减少或消除物料结块及不均匀的现象，有利于气体交换及有机肥发酵的进行[14]。因此，在一定程度上能促进有机肥中真菌正常的生长与繁殖。
Table 5 Effect of ventilation system on fungi community of the bio-organic manure
2.2.2 细菌数量 不同通风方式处理对有机肥中细菌数量的影响结果如表6所示。由表6可知，翻堆3次+不通风、翻堆3次+间歇式通风2个处理4次取样分离到的细菌数量总体变化趋势均为先下降后上升，而不翻堆+间歇式强制通风处理4次取样分离到的细菌数量变化趋势为逐渐下降，其中，翻堆3次+不通风处理4次取样分离到的细菌数量相对较多（仅第2次取样分离的细菌数量少于不翻堆+间歇式强制通风处理）。究其原因，可能是翻堆处理可以破碎结块的物料，使物料分布均匀，从而减少或消除物料结块及不均匀的现象；另外，翻堆有利于气体交换，有利于有机肥中细菌的生长和繁殖。
Table 6 Effect of ventilation system on bacteria community of the bio-organic manure
2.2.3 霉菌数量 不同通风方式处理对有机肥中霉菌数量的影响结果如表7所示。由表7可知，所有3个处理4次取样分离到的霉菌数量变化趋势均为依次下降。其中，翻堆3次+间歇式通风处理分离到的霉菌数量最多。究其原因，可能是翻堆处理与间歇式通风的结合在一定程度上改善了有机肥发酵过程中的通气条件，而通气条件的改善对温度的提高有一定的抑制作用，而温度较低有利于一些霉菌的生长[15]。
Table 7 Effect of ventilation system on mould community of the bio-organic manure
2.3 物料水分对发酵过程中微生物数量的影响
2.3.1 真菌数量 不同物料水分处理对有机肥中真菌数量的影响结果如表8所示，所有3个处理4次取样分离到的真菌数量变化总体趋势均呈下降趋势，其中前2个处理在发酵末期真菌数量有小幅度回升。在发酵的前中期，初始水分75%的处理真菌数量在3个处理中最多，而到了发酵后期（第4次取样），该处理真菌最少。相关文献表明，堆肥的初始相对含水量在40% ～ 70%能保证堆肥的顺利进行[16-17]，初始水分75%的处理的在发酵前中期真菌数量较多，可能是由于该处理初始含水量在75%，而这种较高含水量对有机肥发酵中的一些菌物，尤其是黑曲霉及米曲霉等微生物类群的孢子萌发在一定程度上起到一定的促进作用。随着堆肥发酵进入末期，发酵温度逐渐降低至45 ℃以下（温度通过数显温度探测器测定），该处理所含水分蒸发较慢，可能导致物料间隙含氧不能满足微生物菌对氧的需求，在发酵堆中间接形成厌氧状态，导致发酵末期该处理取样分离到的真菌数量相对较少。相反，其他2个处理相对来说水分比较适中，因此，
关键词：处理方式，生物有机肥，微生物菌群
中图分类号：S572.06 文章编号：1007-5119（2014）05-0033-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.05.007
生态农业的生产需要土壤提供作物生长的营养物质和生存环境，施用生物有机肥可以改善土壤微生物的生长环境，同时也是土壤微生物取得能量和养分的主要来源[1]。施用有机肥一方面可提高土壤的微生物量，以使更多的养分固持在微生物体内免遭流失，从而使土壤保持较高的肥力水平；另一方面还可加速土壤微生物量的周转，死亡的微生物经矿化后能释放出更多的养分供作物吸收。
生物有机肥是多种有益微生物菌群与有机肥结合形成的新型、高效、安全的微生物有机复合肥料[2-7]。而有机肥的发酵是一个生物学过程，在这一过程中，涉及的微生物数目巨大，种类繁多，不同的微生物可利用不同的碳源，每一类微生物都需要适合自身生长繁殖的环境条件，并且对某一种或某一类特定的有机物的分解起作用。目前，有机肥发酵过程中参与的微生物主要有：细菌、放线菌和真
基金项目：贵州省烟草公司遵义市公司科技项目（2011-10）
作者简介：叶江平，男，农艺师，主要从事烟叶生产技术和管理工作。E-mail：superpowerqyx@163.com。*通信作者，E-mail：dingting98@126.com
收稿日期：2013-05-30 修回日期：2013-11-12
菌（包括霉菌和酵母菌）。随着发酵过程中温度和pH等环境条件以及C/N、通风方式、物料水分等处理方式的变化，微生物种群数量也会发生变化，在不同的发酵阶段形成各异的优势菌群，从而对不同的有机物进行分解消化[8-12]。
有机肥的发酵过程是一个复杂的过程，要达到良好的堆制效果，必须控制一些主要影响因素，如碳氮比（C/N）、通风方式、物料水分、温度和pH等。这些因素决定了微生物的活动强度，从而影响堆肥在发酵过程中的速度与品质。本研究比较不同C/N、不同通风方式以及不同物料水分对加入发酵菌剂的有机肥发酵过程中几种常见菌群数量的动态变化，旨在为生物有机肥发酵腐熟标准体系的建立提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 生物菌剂
众和有机物料腐熟剂（青岛天地缘生物技术开发有限公司）为生物有机肥发酵剂，是一种复合微生物菌剂，主要含有枯草芽孢杆菌、黑曲霉及米曲霉等微生物类群。前期试验检测发现，菌剂中含有真菌和细菌分别为0.96×106和0.45×106个/g。
1.2 培养基
PDA培养基（分离真菌用）：马铃薯200 g，琼脂15 g，葡萄糖20 g，水1000 mL。
NA培养基（分离细菌用）：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂15～20 g，水1000 mL，pH 7.2～7.5。
马丁氏（Martin）培养基（分离霉菌用）：葡萄糖10.0 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g，蛋白胨5.0 g，1%孟加拉红水溶液（rose bengal，玫瑰红水溶液）3.3 mL，琼脂15～20 g，蒸馏水1000 mL，氯霉素。
1.3 试验设计
试验于2011年12月中旬至2012年3月中旬在贵州省遵义市正安县谢坝乡有机肥研发工场进行。采用条垛型有氧发酵方式堆积，在条垛底部中间设宽度20 cm、深度10 cm的通风槽，堆垛下宽约180 cm，上宽约90 cm，高度约90 cm，长度根据物料量确定。
试验材料为玉米秸秆和牛粪，按体积将玉米秸秆和牛粪分层堆积，在底层铺一层玉米秸秆后，再铺一层牛粪，在玉米秸秆和牛粪之间洒上发酵菌剂（青岛天地缘生物技术开发有限公司生产，众和有机物料腐熟剂，用量为200 g/t湿物料），共分5层堆积，堆积后盖塑料膜防雨保温。
1.3.1 不同C/N试验 试验为C/N单因素4水平完全随机设计，3次重复，C：N水平分别为20：1、25：1、30：1和35：1。玉米秸秆和牛粪用量（干质量）见表1，玉米秸秆含C量为46.31%、含N量为0.53%，牛粪（风干）含C量为34.16%、含N量为1.78%，用尿素补足物料含N量。翻堆3次进行通风，第1次翻堆在降温期（温度低于50 ℃时）进行，以后每隔15 d进行第2次和第3次翻堆。第1次翻堆补足水分65%，以后不再补充水分。
1.3.2 通风方式试验 试验为通风方式单因素3水平完全随机设计，3次重复，处理水平分别为（1）翻堆3次+不通风；（2）翻堆3次+间歇式通风；（3）不翻堆+间歇式强制通风（保证堆中心含氧量不小于10%）。所有处理C/N均为25：1，间歇式通风为在通风槽进风口安装150 W鼓风机，通过继电器控制鼓风机，鼓风机工作0.5 h，停止1 h，循环往复。
1.3.3 物料水分试验 试验为单因素3水平完全随机设计，3次重复，处理水平分别为（1）初始水分65%，以后不再增加水分，该处理简称初始水分65%；（2）初始水分55%，第1次翻堆补足水分至65%，以后不再增加水分，简称初始水分55%；（3）初始水分75%，以后不再增加水分，简称初始水分 65%。所有处理C：N均为25：1，初始水分调控采用105 ℃温度烘8 h检测试验用玉米秸秆和牛粪含水率（质量比），通过计算各层玉米秸秆和牛粪用量，采用喷水的方法将各处理调控到初始含水率（质量比），处理（2）第1次翻堆补足水分也是先取样检测物料含水率，并测量堆体体积和物料容重，计算需要补充水分量，在第1次翻堆时采用喷水的方法补足水分。
1.4 取样方法
分别于第1、2、3次翻堆和最后成品装袋时共分4次，从堆垛前中后（按条垛长度从中间和距两端1/4处垂直挖开剖面）和上中下（按条垛高度从中间和距上下端1/4处水平位置各取样0.5 kg）取样拌匀后，用四分法取样2份，每份0.5 kg。
1.5 堆肥样品可培养微生物计数
不同处理的堆体中真菌总数、细菌总数和霉菌总数的测定采用稀释平板测数法[13]，混菌接种培养。细菌培养24 h后计数，真菌、霉菌培养72 h后计数。以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，统计有效活菌数目。
2 结 果
2.1 碳氮比对发酵过程中微生物数量的影响
2.1.1 真菌数量 由表2可看出，所有C：N处理水平真菌数量随取样时间的推后呈下降趋势，且随着有机肥发酵的结束，C：N=25：1处理最终检测到的真菌数量远大于C：N=35：1处理，此可能是因为C：N=25：1和C：N=35：1两处理的碳氮在有机肥发酵的前期能较好地满足真菌的生长繁殖，避免了发酵
ganic manure
注：同列内小写字母不同表示5%显著差异，下同。
过程中真菌菌体的衰老以及自溶；而随着发酵的进行，C：N=25：1处理发酵堆体的氧浓度含量大于C：N=35：1处理组（数显氧浓度探测器测定），可能导致有机肥发酵结束，C：N=25：1处理组的真菌数量大于C：N=35：1处理组。
2.1.2 细菌数量 由表3可以看出，除C：N=20：1处理外，其余3个处理4次取样分离到的细菌数量变化总体趋势均为先下降后上升，而C：N=20：1处理4次取样分离到的细菌数量变化总体趋势则为先上升后下降。其中，25：1处理4次取样分离到的细菌数量均较多（仅第3次取样分离的细菌数量少于35：1处理），且发酵末期即第4次取样分离到的细菌数量有明显的上升。究其原因，可能是该处理的碳氮比有利于堆肥中的细菌生长和繁殖，菌群生长较为旺盛，到发酵末期，由于外界温度条件等环境因素的影响，细菌进入了2次生长，导致发酵末期分离到的细菌数量有显著回升。
2.1.3 霉菌数量 由表4可知，所有处理4次取样分离到的霉菌数量变化总体趋势均为依次下降。相对其他处理来说，25：1处理发酵过程中分离到的数量相对较少，且第4次取样时25：1处理分离到的霉菌数量仅为60个/g。
Table 4 Effect of C/N on mould community of the bio-organic manure
2.2 通风方式对发酵过程中微生物数量的影响
2.2.1 真菌数量 由表5可知，所有3个处理真菌数量变化总体均呈下降趋势，其中，不翻堆+间歇式强制通风处理分离到的真菌数量最少，而其余两个处理4次取样分离到的真菌数量相对较多。究其原因，可能是翻堆处理有利于有机肥中真菌的生长和繁殖，翻堆可以破碎结块的物料，使物料分布均匀，从而减少或消除物料结块及不均匀的现象，有利于气体交换及有机肥发酵的进行[14]。因此，在一定程度上能促进有机肥中真菌正常的生长与繁殖。
Table 5 Effect of ventilation system on fungi community of the bio-organic manure
2.2.2 细菌数量 不同通风方式处理对有机肥中细菌数量的影响结果如表6所示。由表6可知，翻堆3次+不通风、翻堆3次+间歇式通风2个处理4次取样分离到的细菌数量总体变化趋势均为先下降后上升，而不翻堆+间歇式强制通风处理4次取样分离到的细菌数量变化趋势为逐渐下降，其中，翻堆3次+不通风处理4次取样分离到的细菌数量相对较多（仅第2次取样分离的细菌数量少于不翻堆+间歇式强制通风处理）。究其原因，可能是翻堆处理可以破碎结块的物料，使物料分布均匀，从而减少或消除物料结块及不均匀的现象；另外，翻堆有利于气体交换，有利于有机肥中细菌的生长和繁殖。
Table 6 Effect of ventilation system on bacteria community of the bio-organic manure
2.2.3 霉菌数量 不同通风方式处理对有机肥中霉菌数量的影响结果如表7所示。由表7可知，所有3个处理4次取样分离到的霉菌数量变化趋势均为依次下降。其中，翻堆3次+间歇式通风处理分离到的霉菌数量最多。究其原因，可能是翻堆处理与间歇式通风的结合在一定程度上改善了有机肥发酵过程中的通气条件，而通气条件的改善对温度的提高有一定的抑制作用，而温度较低有利于一些霉菌的生长[15]。
Table 7 Effect of ventilation system on mould community of the bio-organic manure
2.3 物料水分对发酵过程中微生物数量的影响
2.3.1 真菌数量 不同物料水分处理对有机肥中真菌数量的影响结果如表8所示，所有3个处理4次取样分离到的真菌数量变化总体趋势均呈下降趋势，其中前2个处理在发酵末期真菌数量有小幅度回升。在发酵的前中期，初始水分75%的处理真菌数量在3个处理中最多，而到了发酵后期（第4次取样），该处理真菌最少。相关文献表明，堆肥的初始相对含水量在40% ～ 70%能保证堆肥的顺利进行[16-17]，初始水分75%的处理的在发酵前中期真菌数量较多，可能是由于该处理初始含水量在75%，而这种较高含水量对有机肥发酵中的一些菌物，尤其是黑曲霉及米曲霉等微生物类群的孢子萌发在一定程度上起到一定的促进作用。随着堆肥发酵进入末期，发酵温度逐渐降低至45 ℃以下（温度通过数显温度探测器测定），该处理所含水分蒸发较慢，可能导致物料间隙含氧不能满足微生物菌对氧的需求，在发酵堆中间接形成厌氧状态，导致发酵末期该处理取样分离到的真菌数量相对较少。相反，其他2个处理相对来说水分比较适中，因此，