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摘要：以爱玉的叶片为材料，对CTAB分离总DNA的方法进行了改进，即在提取液中加入β-巯基乙醇、不同的PVP.结果表明：选用爱玉的嫩叶为材料及提取液中加入2%PVP，可有效地去除杂质，防止材料褐化，获得的DNA样品OD260nm/OD280nm比值为1.8左右，质量好且产率较高，电泳检测表明提取的DNA的完整性较好，能基本满足后续的PCR分析及限制性内切酶酶切等分子操作的要求.
关键词：爱玉;DNA;嫩叶;PVP
爱玉（Ficus awkeotsang Makino）是桑科榕属的多年生木质藤本植物，分布于我国福建、浙江南部和台湾等地区。由于爱玉野生资源匮乏以及人工栽培的特殊性，爱玉瘦果供不应求，价格居高不下。台湾自1985年开始人工栽培研究[1] ，20世纪90年代初爱玉作为名特优果树引种大陆，并已推广栽培。
根据爱玉叶片的上述特性，本实验打算在CTAB法提取DNA的基础上进行改良，以获得高纯度的可用于PCR分析、分子杂交及限制性内切酶酶切等操作的基因组DNA，以期为今后爱玉分子生物学研究建立了良好的实验基础。
1材料与方法
1.1材料
供试材料为爱玉，采自宁德市蕉城区，多株混合取样，取新鲜、无病斑的叶片组织，放冰盒中带回实验室，双蒸水洗涤晾干、去除主脉，立即用液氮速冻研磨成干粉，装入50ml离心管中，放-20℃保存备用。
1.2主要试剂及仪器
1.2.1试剂Tris、EDTA、CTAB、β-巯基乙醇、平衡酚、琼脂糖均购自北京Solarbio公司。HCl、NaCl、NaAc、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2.2主要仪器 3-18K型高速冷冻离心机（德国SIGMA）、DYY-6C型电泳仪（北京六一）、DYCP-31E型电泳槽（北京六一）、1-14型台式小型高速离心机（Sigma）、T6新世纪型紫外可见分光光度计（北京普析）、紫外ZF型透射分析仪（上海嘉鹏）、MILLI-QReference超纯水器（美国MILLIPORE）。
1.3方法
1.3.1基因组DNA的提取 参照邹喻平[2] 等人的方法并作改进。
1.3.2叶片取材部位对DNA提取效果的影响取爱玉嫩叶和老叶各5g，参照1.3.1的方法提取DNA。
1.3.3提取缓冲液中PVP加入量对DNA提取效果的影响取爱玉嫩叶为材料，在CTAB提取缓冲液中其它成分不变的条件下，改变PVP的加入量，设如下处理：对照：1%PVP;处理1：2%PVP;处理2：4%PVP;处理3：6%PVP。
1.3.4DNA的纯度分析紫外吸收法[2] ：取DNA原液，稀释50倍，采用紫外吸收法测定OD260nm值和OD280nm值，根据OD260nm比值检测DNA的纯度;按照1个OD260nm值相当于50ug/ml计算DNA的浓度和产率。
1.3.5DNA的质量分析 琼脂糖凝胶电泳法[3] ：取10ulDNA原液加10ul2%溴酚蓝混匀，在1%的瓊脂糖凝胶上电泳，用1×TBE电泳缓冲液，4V·cm-1电压电泳60min。电泳结束后用0.5ug·ml-1EB染色30min后，用紫外透射分析仪观察拍照，检测DNA的提取情况（完整性）。
2结果与分析
2.1取材部位对基因组DNA提取效果的影响
选取爱玉的嫩叶和老叶，利用改良CTAB法提取的爱玉嫩叶DNA沉淀为白色半透明状，可见多酚类物质去除较干净，DNA沉淀易溶解，溶液清亮，无粘稠感;老叶DNA沉淀为淡黄色半透明，可见蛋白质和多酚类物质残留，在此基础上对老叶的DNA进一步纯化，纯化后DNA沉淀颜色为白色半透明状，DNA沉淀易溶解。
2.2提取缓冲液中PVP加入量对DNA提取效果的影响
选取爱玉嫩叶为材料，在CTAB提取缓冲液中其它成分不变的条件下，改变PVP的加入量，提取DNA。结果如表2所示。
2.3基因组DNA凝胶电泳分析
用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的爱玉基因组DNA的完整性，结果如图1所示，各处理（图1中1-8泳道）提取的DNA电泳条整齐，每个泳道上，除了一条核基因组主带外，还有两条卫星带，分别是叶绿体和线粒体的基因组DNA。其中第1-6泳道的点样孔内无杂质，表明酚类物质、多糖去除干净;电泳条带无拖尾，表明所得的DNA没有降解，纯度较高，质量较好。而第7、8泳道的点样孔内略有杂质，说明DNA提取物中含有酚类等杂质，和紫外检测的结果一致。
3讨论
针对爱玉叶片富含多酚、多糖和白色乳状物的特点，本研究在前人研究的基础上对CTAB法进行了相应的改进。首先，取材及材料处理十分关键，尽可能采集新鲜无损伤的叶片进行提取。其次，在提取缓冲液中加入体积分数为2%的β-巯基乙醇和水溶性2%PVP，可有效地去除杂质，防止材料褐化。第三，提取缓冲液中CTAB是一种阳离子去污剂，可破坏细胞膜，并能与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中是可溶的，通过酚抽提离心去除蛋白及多糖物质，加入异丙醇或乙醇后核酸沉淀出来，而CTAB仍保持溶解状态。因此，提取缓冲液中CTAB的加入，既提高了细胞的裂解程度，也可使CTAB充分与DNA结合，从而达到高效纯化和分离的目的。
本研究所建立的DNA提取方法能从爱玉嫩叶基因组中提取出较高质量的DNA，基本满足PCR分析、分子杂交及限制性内切酶酶切等后续操作，为今后爱玉分子生物学研究奠定了良好的实验平台。但是跟其他物种40-120ug/g鲜重的DNA产率相比略低[3] ，有待于进一步改进实验方案，提高DNA产率。
参考文献：
[1] 郑万均.中国树木志：第1卷[M].北京：中国林业出版社，1983：2921-2922.
[2] 邹喻苹，葛颂，王晓东.系统与进化植物学中的分子标记[M].科学出版社，2001：16-17，27-28.
[3] 周延清，杨清香，张改娜.生物遗传标记与应用[M].化学工业出版社，2008：99-100，115-116
（作者单位：平潭县岚华中学）
关键词：爱玉;DNA;嫩叶;PVP
爱玉（Ficus awkeotsang Makino）是桑科榕属的多年生木质藤本植物，分布于我国福建、浙江南部和台湾等地区。由于爱玉野生资源匮乏以及人工栽培的特殊性，爱玉瘦果供不应求，价格居高不下。台湾自1985年开始人工栽培研究[1] ，20世纪90年代初爱玉作为名特优果树引种大陆，并已推广栽培。
根据爱玉叶片的上述特性，本实验打算在CTAB法提取DNA的基础上进行改良，以获得高纯度的可用于PCR分析、分子杂交及限制性内切酶酶切等操作的基因组DNA，以期为今后爱玉分子生物学研究建立了良好的实验基础。
1材料与方法
1.1材料
供试材料为爱玉，采自宁德市蕉城区，多株混合取样，取新鲜、无病斑的叶片组织，放冰盒中带回实验室，双蒸水洗涤晾干、去除主脉，立即用液氮速冻研磨成干粉，装入50ml离心管中，放-20℃保存备用。
1.2主要试剂及仪器
1.2.1试剂Tris、EDTA、CTAB、β-巯基乙醇、平衡酚、琼脂糖均购自北京Solarbio公司。HCl、NaCl、NaAc、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2.2主要仪器 3-18K型高速冷冻离心机（德国SIGMA）、DYY-6C型电泳仪（北京六一）、DYCP-31E型电泳槽（北京六一）、1-14型台式小型高速离心机（Sigma）、T6新世纪型紫外可见分光光度计（北京普析）、紫外ZF型透射分析仪（上海嘉鹏）、MILLI-QReference超纯水器（美国MILLIPORE）。
1.3方法
1.3.1基因组DNA的提取 参照邹喻平[2] 等人的方法并作改进。
1.3.2叶片取材部位对DNA提取效果的影响取爱玉嫩叶和老叶各5g，参照1.3.1的方法提取DNA。
1.3.3提取缓冲液中PVP加入量对DNA提取效果的影响取爱玉嫩叶为材料，在CTAB提取缓冲液中其它成分不变的条件下，改变PVP的加入量，设如下处理：对照：1%PVP;处理1：2%PVP;处理2：4%PVP;处理3：6%PVP。
1.3.4DNA的纯度分析紫外吸收法[2] ：取DNA原液，稀释50倍，采用紫外吸收法测定OD260nm值和OD280nm值，根据OD260nm比值检测DNA的纯度;按照1个OD260nm值相当于50ug/ml计算DNA的浓度和产率。
1.3.5DNA的质量分析 琼脂糖凝胶电泳法[3] ：取10ulDNA原液加10ul2%溴酚蓝混匀，在1%的瓊脂糖凝胶上电泳，用1×TBE电泳缓冲液，4V·cm-1电压电泳60min。电泳结束后用0.5ug·ml-1EB染色30min后，用紫外透射分析仪观察拍照，检测DNA的提取情况（完整性）。
2结果与分析
2.1取材部位对基因组DNA提取效果的影响
选取爱玉的嫩叶和老叶，利用改良CTAB法提取的爱玉嫩叶DNA沉淀为白色半透明状，可见多酚类物质去除较干净，DNA沉淀易溶解，溶液清亮，无粘稠感;老叶DNA沉淀为淡黄色半透明，可见蛋白质和多酚类物质残留，在此基础上对老叶的DNA进一步纯化，纯化后DNA沉淀颜色为白色半透明状，DNA沉淀易溶解。
2.2提取缓冲液中PVP加入量对DNA提取效果的影响
选取爱玉嫩叶为材料，在CTAB提取缓冲液中其它成分不变的条件下，改变PVP的加入量，提取DNA。结果如表2所示。
2.3基因组DNA凝胶电泳分析
用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的爱玉基因组DNA的完整性，结果如图1所示，各处理（图1中1-8泳道）提取的DNA电泳条整齐，每个泳道上，除了一条核基因组主带外，还有两条卫星带，分别是叶绿体和线粒体的基因组DNA。其中第1-6泳道的点样孔内无杂质，表明酚类物质、多糖去除干净;电泳条带无拖尾，表明所得的DNA没有降解，纯度较高，质量较好。而第7、8泳道的点样孔内略有杂质，说明DNA提取物中含有酚类等杂质，和紫外检测的结果一致。
3讨论
针对爱玉叶片富含多酚、多糖和白色乳状物的特点，本研究在前人研究的基础上对CTAB法进行了相应的改进。首先，取材及材料处理十分关键，尽可能采集新鲜无损伤的叶片进行提取。其次，在提取缓冲液中加入体积分数为2%的β-巯基乙醇和水溶性2%PVP，可有效地去除杂质，防止材料褐化。第三，提取缓冲液中CTAB是一种阳离子去污剂，可破坏细胞膜，并能与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中是可溶的，通过酚抽提离心去除蛋白及多糖物质，加入异丙醇或乙醇后核酸沉淀出来，而CTAB仍保持溶解状态。因此，提取缓冲液中CTAB的加入，既提高了细胞的裂解程度，也可使CTAB充分与DNA结合，从而达到高效纯化和分离的目的。
本研究所建立的DNA提取方法能从爱玉嫩叶基因组中提取出较高质量的DNA，基本满足PCR分析、分子杂交及限制性内切酶酶切等后续操作，为今后爱玉分子生物学研究奠定了良好的实验平台。但是跟其他物种40-120ug/g鲜重的DNA产率相比略低[3] ，有待于进一步改进实验方案，提高DNA产率。
参考文献：
[1] 郑万均.中国树木志：第1卷[M].北京：中国林业出版社，1983：2921-2922.
[2] 邹喻苹，葛颂，王晓东.系统与进化植物学中的分子标记[M].科学出版社，2001：16-17，27-28.
[3] 周延清，杨清香，张改娜.生物遗传标记与应用[M].化学工业出版社，2008：99-100，115-116
（作者单位：平潭县岚华中学）