【摘 要】
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目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA敲除小鼠模型。方法根据miRNA基因序列,设计针对miR-301a的gRNA引物序列(双靶点),PCR扩增获得针对miR-301a的体外转录模板DNA和构
【机 构】
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上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科,上海中医药大学附属上海市中医医院肿瘤科,
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目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA敲除小鼠模型。方法根据miRNA基因序列,设计针对miR-301a的gRNA引物序列(双靶点),PCR扩增获得针对miR-301a的体外转录模板DNA和构建Cas9体外转录模板,然后进行Cas9和gRNA体外转录。利用体外转录的gRNA/Cas9mRNA对小鼠受精卵显微注射,并利用T7E1酶切和基因测序对miR-301a突变进行检测和鉴定。结果 PCR扩增、凝胶电泳和基因测序鉴定证实,获得序列正确的用于体外转录的模板DNA;体外转录获得gRNA/Cas9mRNA,顺利完成对小鼠受精卵的显微注射;利用T7E1酶切对miR-301a突变进行检测,发现8只新生小鼠中有7只(87.5%)被鉴定在miR-301a位点携带突变;基因测序结果显示,各小鼠均有不同程度的碱基插入或缺失突变,其中缺失碱基数目最多的4号小鼠产生31个碱基缺失。结论成功建立miR-301a基因高效敲除小鼠模型。
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