论文部分内容阅读
目的
构建环氧合酶2 (COX-2)慢病毒载体，并建立高表达COX-2乳腺癌细胞株MCF7，研究COX-2在乳腺癌细胞增殖中的作用。
方法利用COX-2 PCR全长引物和COX2的cDNA载体获得COX-2编码区全长PCR产物。经限制性内切酶BamHⅠ和XholⅠ切割PCR产物及慢病毒载体plvx-DsRed-Monomer-N1，连接酶连接，转化，测序，进而获得慢病毒载体plvx-COX-2-DsRed。后经嘌呤霉素筛选，得到带有红色荧光标记的稳定高表达COX-2乳腺癌细胞系MCF7-plvx-COX-2-DsRed，并利用实时PCR和Western blot进行验证。利用平板克隆和Western blot对比高表达COX-2 MCF7细胞系与正常MCF7细胞系的增殖能力的差异。
结果利用PCR技术获得COX-2载体后，筛选获得稳定高表达COX-2乳腺癌细胞系MCF7-plvx-COX-2-DsRed。生长曲线检测示，第2天起MCF7-plvx-COX-2-DsRed细胞较MCF7及MCF7-plvx-DsRed-Monomer-N1细胞生长速度明显增快（P<0.05），平板克隆实验亦得出一致结果。经过蛋白相对定量分析，MCF7-plvx-COX-2-DsRed细胞株较MCF7和MCF7-plvx-DsRed-Monomer-N1细胞株的c-myc的表达量多（P<0.05），β-catenin表达量减少（P<0.05）。
结论成功构建慢病毒载体plvx-COX-2-DsRed和高表达COX-2乳腺癌细胞株，并在RNA和蛋白水平加以验证。COX-2可能通过上调c-myc的表达，增强MCF7细胞增殖能力。