【摘 要】
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目的:构建Cec4a的原核重组表达体系,通过诱导表达、酶切纯化获得重组蛋白,并检测产物的抗菌活性.方法:基于Cec4a的序列设计引物,克隆Cec4a基因的DNA片段.利用原核表达载体(pCold-SUMO)构建重组原核表达质粒,并将其转化到大肠杆菌C41(DE3)等感受态细胞,使用IPTG进行诱导表达.通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得含有His-SUMO标签的重组Cec4a融合蛋白.在SUMO蛋白酶酶切后,再次使用Ni-NTA亲和层析纯化,得到目的蛋白,最后用鲍曼不动杆菌(ATCC19606)作为指示
【机 构】
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贵州医科大学生物与工程学院/基础医学院 贵阳 550025;贵州医科大学生物与工程学院/基础医学院 贵阳 550025;环境污染与疾病监控教育部重点实验室 贵阳 550025
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目的:构建Cec4a的原核重组表达体系,通过诱导表达、酶切纯化获得重组蛋白,并检测产物的抗菌活性.方法:基于Cec4a的序列设计引物,克隆Cec4a基因的DNA片段.利用原核表达载体(pCold-SUMO)构建重组原核表达质粒,并将其转化到大肠杆菌C41(DE3)等感受态细胞,使用IPTG进行诱导表达.通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得含有His-SUMO标签的重组Cec4a融合蛋白.在SUMO蛋白酶酶切后,再次使用Ni-NTA亲和层析纯化,得到目的蛋白,最后用鲍曼不动杆菌(ATCC19606)作为指示菌检测表达产物的抗菌活性.结果:成功构建pCold-SUMO-Cec4a原核表达质粒,测序分析其序列与预期结果一致.Cec4a融合蛋白表达量为42.8mg/L,纯化后的Cec4a重组蛋白对鲍曼不动杆菌的MIC为4 μg/mL.结论:通过原核表达,并经Ni-NTA亲和层析纯化,获得了具有抗菌活性的重组蛋白Cec4a,为研究Cec4a的生物活性、抗菌机制及应用奠定了基础.
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