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【摘 要】 我国中药资源丰富，但来源复杂，存在着难以定性定量分析等的问题。因此，DNA分子标记技术在中药鉴别中的作用日渐受到重视。本文介绍了分子标记的概念、发展简史以及其在中药研究中的应用。
【关键词】 分子标记 中药 发展与应用
随着人们对生命认识的不断加深以及遗传学的不断深入发展，越来越多的遗传标记被发现，遗传标记的种类和数量越来越多。遗传标记具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，主要分为4种类型，即形态标记、细胞学标记、生化标记和分子标记。本文介绍的DNA分子标记技术便是指狭义的分子标记。
1 DNA分子标记发展简史
1974年，Grozdicker等人发现了第一个分子标记技术—RFLP标记技术。限制性片段长度多态性标记的原理是先用限制性内切酶酶解样品DNA[1]。1982年，Hamade发现了简单序列重复标记（SSR）[2]。1987年Muills和Faloona发明了PCR技术。在1990年与1995年之间，先后发明了随機扩增多态性DNA标记（RAPD）、任意引物PCR（AP-PCR）、表达序列标签（EST）标记技术、扩展片段长度多态性标记（AFLP）、简单重复间序列标记（ISSR）等技术。1998年，单核苷酸多态性（SNP）标记诞生了。2001年Li和Quiros提出了基于聚合酶链反应（PCR）的相关序列扩增多态性（SRAP），2003年Hu和Vick提出了基于PCR的靶位区域扩增多态性（TRAP）。
2 以Southern杂交为基础的分子标记技术
2.1 限制性片段长度多态性标记（RFLP）
RFLP标记技术是第一代分子标记技术，其原理是首先用限制性内切酶酶解样品DNA，从而产生大量的限制性片段，通过凝胶电泳分离DNA片段。但其对DNA的要求较高，实验材料要求为新鲜样品，无法适用于干燥中药材的鉴别，所以该技术在中药材的鉴别中几乎被淘汰[3]。此类标记技术曾报道过被用于北沙参、柴胡、三岛柴胡以及茅苍术、北苍术、关苍术的鉴定[4]。
3 以PCR为基础的分子标记技术
3.1 随机扩增多态性DNA标记（RAPD）
RAPD即随机扩增多态性DNA标记技术，是在上世纪90年代，由Williams和Welsh发明的分子标记技术，它利用PCR技术，从扩增的片段上分析物种多样性，扩增了的片段通过凝胶电泳清晰地显现出来，经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物的多态性，RAPD所需的引物长度为10个核苷酸左右。
江香梅等[5]将RAPD标记用于朱砂根的遗传多样性分析，收集来自不同地区的30个样本，采用12条经过复筛的RAPD引物对朱砂根群体进行扩增，其中引物S142扩增的多态性条带数最多。
3.2 任意引物PCR（AP-PCR）
AP-PCR即任意引物PCR，是在对所扩增的基因序列一无所知的情况下随意设计或选择一个非特异性引物，在PCR反应体系中，用一个随机核苷酸序列的寡聚核苷酸引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行电泳分析，以达到鉴别的目的。
苏应娟等[6]使用AP-PCR技术对中药厚朴、凹叶厚朴等进行指纹图谱分析， 用16个长短不一的随机寡核苷酸链引物进行扩增，得到的多态性扩增条带占总条带数的75.6%，根据琼脂糖凝胶电泳上显示的不同带型，准确的区别了厚朴及其常见混淆品。
4 以重复顺序为基础的标记技术
4.1 简单重复序列（SSR）
简单重复序列（SSR）又称微卫星，是一类由几个（一般为1～6个）碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，在100bp之内，每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。
徐石勇等[7]对中药杜仲进行了SSR标记分析，以金银花、金银花4倍体灰、华南忍冬、毡毛忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬等为材料，从25对SSR引物中筛选出13对能扩增出特异性条带的引物，且构建了金银花SSR指纹图谱，结果表明山银花与金银花的遗传相似度仅为0.28，亲缘关系较远。
5 以mRNA为基础的分子标记技术
5.1 序列标签位点（STS）
序列标签位点（STS）是基因组上定位明确、作为界标并能通过PCR扩增被唯一操作的短的、单拷贝DNA序列，用于产生作图位点。其基本原理为，依据单拷贝的RFLP探针、微卫星序列、Alu因子等两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增，再经过电泳以显示扩增产物的多态性。
6 以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术
6.1 单核苷酸多态性（SNP）
SNP标记是第三代分子标记，是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP标记技术具有遗传稳定性高、位点丰富且分布广泛等特点[8]。
李纪勤等[9]采用SNP标记技术对栉孔扇贝进行了多态性分析，用4个来自不同地区的野生群体进行实验，并进行了引物以及探针的设计，获得4个品种的33个多态SNP位点信息。
经过几十年的发展，分子标记技术已日趋完善，相信在未来，分子标记技术将更加广泛的应用于中药的鉴别。Chp2010收载了用分子标记技术鉴别中药浙贝母[10]。除浙贝母外，乌梢蛇作为常见中药材，其鉴定方法也被收录于Chp2010。由此可见，分子标记技术在中药鉴别中的作用已受到官方认可，有较大的发展潜力。当然，不能仅仅依靠DNA分子标记技术用于中药的鉴定，还应该加大投入，开辟新的中药鉴定的方法，如结合DNA条形码技术，高效液相色谱技术、光谱等，能够有效解决中药材混淆品泛滥的问题[11-15]。
参考文献
[1]Qiang Xu， Xiaopeng Wen， Xiuxin Deng. A simple protocol for isolating genomic DNA from chestnut rose （Rosa roxburghii tratt） for RFLP and PCR analyses. Plant Molecular Biology Reporter，2004，22：301-302.
[2]李力，徐永莉，张月云，赵成坚. DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析[J]. 时珍国医国药，2009，11：2845-2847.
[3]曹晖，刘玉萍. 分子标记技术在中药品种鉴别中的应用[J]. 中国药学杂志，1998，05：15-19.
[4]江香梅，温强，叶金山，江梅. 朱砂根群体遗传多样性RAPD分析[J]. 江西农业大学学报，2006，05：762-765+779.
[5]苏应娟，朱建明，王艇，李雪雁，曾庆文，夏念和. 厚朴的任意引物PCR指纹图谱分析[J]. 中草药，2002，06：68-71.
【关键词】 分子标记 中药 发展与应用
随着人们对生命认识的不断加深以及遗传学的不断深入发展，越来越多的遗传标记被发现，遗传标记的种类和数量越来越多。遗传标记具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，主要分为4种类型，即形态标记、细胞学标记、生化标记和分子标记。本文介绍的DNA分子标记技术便是指狭义的分子标记。
1 DNA分子标记发展简史
1974年，Grozdicker等人发现了第一个分子标记技术—RFLP标记技术。限制性片段长度多态性标记的原理是先用限制性内切酶酶解样品DNA[1]。1982年，Hamade发现了简单序列重复标记（SSR）[2]。1987年Muills和Faloona发明了PCR技术。在1990年与1995年之间，先后发明了随機扩增多态性DNA标记（RAPD）、任意引物PCR（AP-PCR）、表达序列标签（EST）标记技术、扩展片段长度多态性标记（AFLP）、简单重复间序列标记（ISSR）等技术。1998年，单核苷酸多态性（SNP）标记诞生了。2001年Li和Quiros提出了基于聚合酶链反应（PCR）的相关序列扩增多态性（SRAP），2003年Hu和Vick提出了基于PCR的靶位区域扩增多态性（TRAP）。
2 以Southern杂交为基础的分子标记技术
2.1 限制性片段长度多态性标记（RFLP）
RFLP标记技术是第一代分子标记技术，其原理是首先用限制性内切酶酶解样品DNA，从而产生大量的限制性片段，通过凝胶电泳分离DNA片段。但其对DNA的要求较高，实验材料要求为新鲜样品，无法适用于干燥中药材的鉴别，所以该技术在中药材的鉴别中几乎被淘汰[3]。此类标记技术曾报道过被用于北沙参、柴胡、三岛柴胡以及茅苍术、北苍术、关苍术的鉴定[4]。
3 以PCR为基础的分子标记技术
3.1 随机扩增多态性DNA标记（RAPD）
RAPD即随机扩增多态性DNA标记技术，是在上世纪90年代，由Williams和Welsh发明的分子标记技术，它利用PCR技术，从扩增的片段上分析物种多样性，扩增了的片段通过凝胶电泳清晰地显现出来，经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物的多态性，RAPD所需的引物长度为10个核苷酸左右。
江香梅等[5]将RAPD标记用于朱砂根的遗传多样性分析，收集来自不同地区的30个样本，采用12条经过复筛的RAPD引物对朱砂根群体进行扩增，其中引物S142扩增的多态性条带数最多。
3.2 任意引物PCR（AP-PCR）
AP-PCR即任意引物PCR，是在对所扩增的基因序列一无所知的情况下随意设计或选择一个非特异性引物，在PCR反应体系中，用一个随机核苷酸序列的寡聚核苷酸引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行电泳分析，以达到鉴别的目的。
苏应娟等[6]使用AP-PCR技术对中药厚朴、凹叶厚朴等进行指纹图谱分析， 用16个长短不一的随机寡核苷酸链引物进行扩增，得到的多态性扩增条带占总条带数的75.6%，根据琼脂糖凝胶电泳上显示的不同带型，准确的区别了厚朴及其常见混淆品。
4 以重复顺序为基础的标记技术
4.1 简单重复序列（SSR）
简单重复序列（SSR）又称微卫星，是一类由几个（一般为1～6个）碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，在100bp之内，每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。
徐石勇等[7]对中药杜仲进行了SSR标记分析，以金银花、金银花4倍体灰、华南忍冬、毡毛忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬等为材料，从25对SSR引物中筛选出13对能扩增出特异性条带的引物，且构建了金银花SSR指纹图谱，结果表明山银花与金银花的遗传相似度仅为0.28，亲缘关系较远。
5 以mRNA为基础的分子标记技术
5.1 序列标签位点（STS）
序列标签位点（STS）是基因组上定位明确、作为界标并能通过PCR扩增被唯一操作的短的、单拷贝DNA序列，用于产生作图位点。其基本原理为，依据单拷贝的RFLP探针、微卫星序列、Alu因子等两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增，再经过电泳以显示扩增产物的多态性。
6 以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术
6.1 单核苷酸多态性（SNP）
SNP标记是第三代分子标记，是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP标记技术具有遗传稳定性高、位点丰富且分布广泛等特点[8]。
李纪勤等[9]采用SNP标记技术对栉孔扇贝进行了多态性分析，用4个来自不同地区的野生群体进行实验，并进行了引物以及探针的设计，获得4个品种的33个多态SNP位点信息。
经过几十年的发展，分子标记技术已日趋完善，相信在未来，分子标记技术将更加广泛的应用于中药的鉴别。Chp2010收载了用分子标记技术鉴别中药浙贝母[10]。除浙贝母外，乌梢蛇作为常见中药材，其鉴定方法也被收录于Chp2010。由此可见，分子标记技术在中药鉴别中的作用已受到官方认可，有较大的发展潜力。当然，不能仅仅依靠DNA分子标记技术用于中药的鉴定，还应该加大投入，开辟新的中药鉴定的方法，如结合DNA条形码技术，高效液相色谱技术、光谱等，能够有效解决中药材混淆品泛滥的问题[11-15]。
参考文献
[1]Qiang Xu， Xiaopeng Wen， Xiuxin Deng. A simple protocol for isolating genomic DNA from chestnut rose （Rosa roxburghii tratt） for RFLP and PCR analyses. Plant Molecular Biology Reporter，2004，22：301-302.
[2]李力，徐永莉，张月云，赵成坚. DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析[J]. 时珍国医国药，2009，11：2845-2847.
[3]曹晖，刘玉萍. 分子标记技术在中药品种鉴别中的应用[J]. 中国药学杂志，1998，05：15-19.
[4]江香梅，温强，叶金山，江梅. 朱砂根群体遗传多样性RAPD分析[J]. 江西农业大学学报，2006，05：762-765+779.
[5]苏应娟，朱建明，王艇，李雪雁，曾庆文，夏念和. 厚朴的任意引物PCR指纹图谱分析[J]. 中草药，2002，06：68-71.