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摘要 [目的]筛选黄化曲叶病毒病抗性高的番茄杂交子1代。[方法]通过番茄杂种子1代的栽培，观测各组合的田间生长情况，对各组合果实营养品质指标进行测定和分析，采用分子标记等方法对其黄化曲叶病毒病抗性进行鉴定。[结果]杂交子1代TW002和TW008果实品质较优，在加工、运输、贮藏方面具有优势；与TW002相比，TW008的果实商品率更高、营养品质更好。黄化曲叶病毒病抗性基因检测结果表明，Ty-1中TW001、TW004、TW008和TW010为抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009为杂合材料，TW002、TW007为感病材料；Ty-2中均为感病材料；Ty-3中TW001、TW002、TW004、TW007、TW009为抗病杂合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010为感病纯合材料。[结论]该研究可为抗黄化曲叶病毒病番茄材料的选育提供理论依据。
关键词 番茄黄化曲叶病毒；分子标记；杂交子1代；选择；营养品质
中图分类号 S641.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）29-0014-03
番茄（Lycopersicon esculentum Miller.）为双子叶植物纲茄科 （Solanaeeae）番茄属（Lycopersion）植物。番茄营养丰富，富含人们正常生活所需的各种物质，如蛋白质、碳水化合物、维生素C、胡萝卜素和番茄红素等[1]。番茄黄化曲叶病是由番茄黄化曲叶病毒（ Tomato yellow leaf curl cirus，TYLCV） 引起的，该病毒主要通过烟粉虱（Bemisia tobaci）传染给番茄[2]。该病传播迅速、范围广、危害程度严重、持续久，严重影响番茄的品质和产量。目前番茄黄化曲叶病毒病的防治措施主要是使用抗性品种和农药。长期使用农药易出现农药残留、土壤板结、环境污染、毒素积累等问题，不利于生态农业的发展以及环境的保护，因此现在多采用综合生物防治的方法来防治番茄黄化曲叶病毒病[3]。1994 年，国外学者研究发现智利番茄是最好的番茄抗黄化曲叶病毒病资源[4]。Vidavsky等[5]从番茄中发现抗黄化曲叶病毒基因。Zamir等[6]利用RFLP标记，首次将番茄抗黄化曲叶病的基因定位在6号染色体上（位于着丝粒端），并将其命名为Ty-1，且RFLP标记方法也被应用于Ty-1的抗病辅助育种中。Hanson等[7] 以野生多毛番茄为材料，利用RFLP标记将番茄抗黄化曲叶病的基因定位在了11号染色体的长臂终端上，并将其命名为Ty-2，该方法也被应用于Ty-2的抗病辅助育种中。Ji等[8]以智利番茄为材料，利用RAPD标记确定了抗性位点在第6号染色体上，并将抗性基因命名为Ty-3和Ty-3a。目前，我国番茄黄化曲叶病毒病的危害日趋严重，且番茄抗黄化曲叶病毒病的材料品种较少。基于此，笔者以番茄杂交子1代为研究对象展开试验，观测不同组合材料的田间生长情况、农艺性状表现，利用分子标记等方法对其黄化曲叶病毒病抗性进行鉴定，以期筛选出黄化曲叶病毒病抗性高的番茄杂交子1代，为抗黄化曲叶病毒病番茄材料的选育提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验所用的杂交子1代按TW001～TW010进行编号。这10份材料均由广西大学农学院园艺系番茄课题组提供；对照组（CK）为当前市场上种植面积较为广泛的“艾比利”品种。
1.2 果实营养品质测定项目和方法 每个小区随机抽取3个第2穗外观较好的番茄果实，重复3次，取平均值。果实可溶性固形物含量采用手持折光仪测定[9]；可滴定酸含量采用酸碱滴定法（GB10474-89）测定[10]；抗坏血酸含量采用2，6-二氯酚靛酚滴定法测定[11]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[12]；番茄红素含量采用萃取比色法测定；计算糖酸比（可溶性糖与可滴定酸的比值）；利用隶属函数[13]判定果实综合品质，其基本原理是根据评价的标准来构造多个隶属函数，然而每一个评价指标在各个隶属函数的对应程度不同，通过模糊计算，可以得到综合指标对各个隶属函数的数值得分影响。
1.3 番茄抗性基因的检测
1.3.1 试剂和仪器。试剂：2×CTAB（pH 8.0）、NaCl、 EDAB、Tris-d（pH 8.0）、氯仿、异丙醇、醋酸钠、琼脂粉、液氮、无水乙醇、TE缓冲液、dNTP、TEA溶液、Taq DNA聚合酶、MgCl2、BUFFER、6×Loading Buffer、染色碱、2 000 DNA Marker、MIX酶、nuclear free water。仪器：研钵、水浴锅、振荡机、移液枪、点样板、冰箱、磨样机、Sigma1冷冻离心机、ABI 2720 PCR仪、Q5000型核酸蛋白仪、君意JY600C型电泳仪、微波炉、ChemiDoc MP型凝胶成像系统。
1.3.2 DNA的提取。采用改良的CTAB法对番茄材料基因组的DNA进行提取。
1.3.3 PCR反应体系。①黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1参照华中农业大学番茄课题组开发的双重SNP标记[14]；反应体系20 μL：2.0 μL的10× Buffer with Mg2+，0.4 μL的dNTPs（2.5 mM），正向引物和反向引物（100 μmol/L）各0.2 μL，1.0 μL的DNA 模板（200 ng/μL），0.2 U的Taq DNA聚合酶，ddH2O 补足20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性，1 min，58 ℃复性，1 min，72 ℃延伸，1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保持。②黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3参照中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供引物程序进行检测。反应体系10 μL： 5 μL的2×Go Taq Green Master Mix，正向引物和反向引物各0.25 μL，3.50 μL的灭菌ddH2O，1.00 μL的DNA模板（1 000 ng/μL）。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性，40 s，55 ℃复性，40 s，72 ℃延伸，1 min 30 s，32个循环；最后72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。 1.3.4 PCR及酶切产物检测。PCR产物及酶切产物在1.5%的琼脂糖凝胶上 220 V 恒压电泳15 min，结果采用2 000 DNA Marker染色，ChemiDoc MP型凝胶成像系统拍照。
1.4 数据处理 采用Excel 2007以及SPSS 20.0软件对数据进行处理。
2 结果与分析
2.1 番茄果实品质比较 由表1可知，TW001～TW010番茄果实中的可溶性固形物含量在6.05%～7.64%，其中TW008果实中可溶性固形物含量最高，为7.64%，TW003果实中可溶性固形物含量最低，为6.05%，TW001与TW007之间差异不显著，其余杂交子1代之间差异显著；番茄果实中的可滴定酸含量在327.89～657.55 mg/100 g，其中TW004果实中可滴定酸含量最高，为657.55 mg/100 g， TW001果实中可滴定酸含量最低，为327.89 mg/100 g，TW001与TW004、TW007之间均差异显著，其他材料间均差异不显著；番茄果实中番茄红素含量在24.72～46.79 mg/100 g，其中TW008果实中番茄红素含量最高（为46.79 mg/100 g），TW003果实中番茄红素含量最低（为24.72 mg/100 g），TW001、TW003、TW005、TW007、TW008、TW010、CK之间均差异显著，TW002与TW006之间差异不显著；番茄果实中抗坏血酸含量在13.35～31.72 mg/100 g，其中TW008果实中抗坏血酸含量最高，TW003果实中抗坏血酸含量最低，10个杂交子1代材料中除TW010外，其余材料之间均差异显著；番茄果实中可溶性糖含量在297.66～526.80 mg/100 g，其中TW002果实中可溶性糖含量最高，TW006果实中可溶性糖含量最低，这10个杂交子1代材料之间均差异显著；番茄果实中糖酸比在0.49～1.22，其中TW001果实中糖酸比最高， TW007果实中糖酸比最低，这10个杂交子1代材料之间均差异显著。根据隶属函数值可知，TW008得分最高，说明其番茄果实品质最好，TW001、TW002、TW004、TW005、TW007、TW008、TW009和TW010的数值均高于CK，因此，这8个材料均可在广西地区进行推广种植。
2.2 抗性鉴定分析
2.2.1 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1检测结果。Ty-1基因的双重SNP标记可检测出抗病纯合、抗病杂合、感病纯合材料，当纯合抗病材料经过PCR电泳过后，会出现1条965 bp的条带，杂合抗性材料会出现965 bp和1 343 bp 2条DNA带，而纯合感病材料会出现1条1 434 bp的条带。由图1可知，TW001、TW004、TW008和TW010为抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009为杂合材料，TW002、TW007为感病材料。
2.2.2 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2检测结果。含有黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2的材料可扩增出300 bp的条带，不含黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2的感病材料则扩增出600 bp的条带。由图2可知，所有的材料均为感病材料。
2.2.3 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3检测结果。含有黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的材料可扩增出500 bp的条带，不含黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的材料可扩增出320 bp的条带。由图3可知，TW001、TW002、TW004、TW007、TW009为抗病杂合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010为感病纯合材料。
3 结论与讨论
（1）该试验结果表明，杂交子1代TW002和TW008的可滴定酸、可溶性糖、抗坏血酸含量均较高，其口味、风味、甜酸比、酸碱度等较优，更有益于贮藏，在加工、运输方面均有优势，与TW002相比，TW008的果实商品率更高、营养品质更好。与对照品种“艾比利”相比，10个杂交子1代中有8个得分高于“艾比利”，尤其是TW008，适合大面积推广。
（2）黄化曲叶病毒病抗性基因检测结果表明，Ty-1中TW001、TW004、TW008和TW010为抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009为杂合材料，TW002、TW007为感病材料；Ty-2中均为感病材料；Ty-3中TW001、TW002、TW004、TW007、TW009为抗病杂合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010为感病纯合材料。TW001、TW004为纯合体且抗Ty-1和Ty-3，可作为亲本材料；TW003、TW005、TW006、TW009均为杂合材料，需继续纯化；TW002、TW007材料经济性状一般，但感Ty-1、抗Ty-3。TW008感病但经济性状好，可作母本，TW010感病又无性状，应该淘汰。
参考文献
[1]
程智慧.园艺学概论[M].2版.北京：中国农业出版社，2010：183-188.
[2] PENG J Y，ZHAN L B，DONG F Q，et al.A comparative study of chromatographic methods for separating chemical compounds from Spiranthes aus-tralis （R.Brown） Lindl roots[J].Separation and purification technology，2008，59（3）：262-269.
[3] 丁雪玲.番茄黄化曲叶病毒病的生物防治研究[D].南京：南京农业大学，2013.
[4] MICHELSON I，ZAMIR D，CZOSNEK H.Accumulation and translocation of tomato yellow leaf curl virus （TYLCV） in a Lycopersicon esculentum breeding line containing the L.chilense TYLCV tolerance gene Ty-1[J].Phytopathology，1994，84（9）： 928-933. [5] VIDAVSKY F，CZOSNEK H.Tomato breeding lines resistant and tolerant to tomato yellow leaf curl virus issued from Lycopersicon hirsutum[J].Phytopathology，1998，88（9）：910-914.
[6] ZAMIR D，EKSTEIN-MICHELSON I，ZAKAY Y，et al.Mapping and introgression of a tomato yellow leaf curl virus tolerance gene，Ty-1[J].Theoretical and applied genetics，1994，88（2）：141-146.
[7] HANSON P M，BERNACCHI D，GREEN S，et al.Mapping of a wild tomato introgression associated with tomato yellow leaf curl virus resistance in a cultivated tomato line[J].Journal of the American societyof horticultural science， 2000，125（1）：15-20.
[8] JI Y F， SCOTT J W，SCHUSTER D J， et al.Molecular mapping of Ty-4， a new tomato yellow leaf curl virus resistance locus on chromosome 3 of tomato[J].Journal of the American society for horticultural science，2009，134（2）：281-288.
[9] 罗颖.番茄可溶性固形物含量与相关生理生化指标关系研究[D].石河子：石河子大学，2010.
[10] 李玲，李娘辉，蒋素梅，等.植物生理学模块实验指导[M].北京：科学出版社，2009：48-59.
[11] 李合生.植物生理生化实验手册[M].北京：高等教育出版，2001：130，134-138.
[12] 毕颖，刘燕，张平，等.蒽酮比色法测定大豆乳清废水中总糖含量[J]. 大豆通报，2006（3）：24-25.
[13] 韩瑞宏，卢欣石，高桂娟，等.紫花苜蓿抗旱性主成分及隶属函数分析田[J].草地学报，2006，14（2）：142-146.
[14] 葛乃蓬，崔龙，李汉霞，等.番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-1的双重SNP标记的开发[J].园艺学报，2014，41（8）：1583-1590.
关键词 番茄黄化曲叶病毒；分子标记；杂交子1代；选择；营养品质
中图分类号 S641.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）29-0014-03
番茄（Lycopersicon esculentum Miller.）为双子叶植物纲茄科 （Solanaeeae）番茄属（Lycopersion）植物。番茄营养丰富，富含人们正常生活所需的各种物质，如蛋白质、碳水化合物、维生素C、胡萝卜素和番茄红素等[1]。番茄黄化曲叶病是由番茄黄化曲叶病毒（ Tomato yellow leaf curl cirus，TYLCV） 引起的，该病毒主要通过烟粉虱（Bemisia tobaci）传染给番茄[2]。该病传播迅速、范围广、危害程度严重、持续久，严重影响番茄的品质和产量。目前番茄黄化曲叶病毒病的防治措施主要是使用抗性品种和农药。长期使用农药易出现农药残留、土壤板结、环境污染、毒素积累等问题，不利于生态农业的发展以及环境的保护，因此现在多采用综合生物防治的方法来防治番茄黄化曲叶病毒病[3]。1994 年，国外学者研究发现智利番茄是最好的番茄抗黄化曲叶病毒病资源[4]。Vidavsky等[5]从番茄中发现抗黄化曲叶病毒基因。Zamir等[6]利用RFLP标记，首次将番茄抗黄化曲叶病的基因定位在6号染色体上（位于着丝粒端），并将其命名为Ty-1，且RFLP标记方法也被应用于Ty-1的抗病辅助育种中。Hanson等[7] 以野生多毛番茄为材料，利用RFLP标记将番茄抗黄化曲叶病的基因定位在了11号染色体的长臂终端上，并将其命名为Ty-2，该方法也被应用于Ty-2的抗病辅助育种中。Ji等[8]以智利番茄为材料，利用RAPD标记确定了抗性位点在第6号染色体上，并将抗性基因命名为Ty-3和Ty-3a。目前，我国番茄黄化曲叶病毒病的危害日趋严重，且番茄抗黄化曲叶病毒病的材料品种较少。基于此，笔者以番茄杂交子1代为研究对象展开试验，观测不同组合材料的田间生长情况、农艺性状表现，利用分子标记等方法对其黄化曲叶病毒病抗性进行鉴定，以期筛选出黄化曲叶病毒病抗性高的番茄杂交子1代，为抗黄化曲叶病毒病番茄材料的选育提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验所用的杂交子1代按TW001～TW010进行编号。这10份材料均由广西大学农学院园艺系番茄课题组提供；对照组（CK）为当前市场上种植面积较为广泛的“艾比利”品种。
1.2 果实营养品质测定项目和方法 每个小区随机抽取3个第2穗外观较好的番茄果实，重复3次，取平均值。果实可溶性固形物含量采用手持折光仪测定[9]；可滴定酸含量采用酸碱滴定法（GB10474-89）测定[10]；抗坏血酸含量采用2，6-二氯酚靛酚滴定法测定[11]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[12]；番茄红素含量采用萃取比色法测定；计算糖酸比（可溶性糖与可滴定酸的比值）；利用隶属函数[13]判定果实综合品质，其基本原理是根据评价的标准来构造多个隶属函数，然而每一个评价指标在各个隶属函数的对应程度不同，通过模糊计算，可以得到综合指标对各个隶属函数的数值得分影响。
1.3 番茄抗性基因的检测
1.3.1 试剂和仪器。试剂：2×CTAB（pH 8.0）、NaCl、 EDAB、Tris-d（pH 8.0）、氯仿、异丙醇、醋酸钠、琼脂粉、液氮、无水乙醇、TE缓冲液、dNTP、TEA溶液、Taq DNA聚合酶、MgCl2、BUFFER、6×Loading Buffer、染色碱、2 000 DNA Marker、MIX酶、nuclear free water。仪器：研钵、水浴锅、振荡机、移液枪、点样板、冰箱、磨样机、Sigma1冷冻离心机、ABI 2720 PCR仪、Q5000型核酸蛋白仪、君意JY600C型电泳仪、微波炉、ChemiDoc MP型凝胶成像系统。
1.3.2 DNA的提取。采用改良的CTAB法对番茄材料基因组的DNA进行提取。
1.3.3 PCR反应体系。①黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1参照华中农业大学番茄课题组开发的双重SNP标记[14]；反应体系20 μL：2.0 μL的10× Buffer with Mg2+，0.4 μL的dNTPs（2.5 mM），正向引物和反向引物（100 μmol/L）各0.2 μL，1.0 μL的DNA 模板（200 ng/μL），0.2 U的Taq DNA聚合酶，ddH2O 补足20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性，1 min，58 ℃复性，1 min，72 ℃延伸，1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保持。②黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3参照中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供引物程序进行检测。反应体系10 μL： 5 μL的2×Go Taq Green Master Mix，正向引物和反向引物各0.25 μL，3.50 μL的灭菌ddH2O，1.00 μL的DNA模板（1 000 ng/μL）。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性，40 s，55 ℃复性，40 s，72 ℃延伸，1 min 30 s，32个循环；最后72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。 1.3.4 PCR及酶切产物检测。PCR产物及酶切产物在1.5%的琼脂糖凝胶上 220 V 恒压电泳15 min，结果采用2 000 DNA Marker染色，ChemiDoc MP型凝胶成像系统拍照。
1.4 数据处理 采用Excel 2007以及SPSS 20.0软件对数据进行处理。
2 结果与分析
2.1 番茄果实品质比较 由表1可知，TW001～TW010番茄果实中的可溶性固形物含量在6.05%～7.64%，其中TW008果实中可溶性固形物含量最高，为7.64%，TW003果实中可溶性固形物含量最低，为6.05%，TW001与TW007之间差异不显著，其余杂交子1代之间差异显著；番茄果实中的可滴定酸含量在327.89～657.55 mg/100 g，其中TW004果实中可滴定酸含量最高，为657.55 mg/100 g， TW001果实中可滴定酸含量最低，为327.89 mg/100 g，TW001与TW004、TW007之间均差异显著，其他材料间均差异不显著；番茄果实中番茄红素含量在24.72～46.79 mg/100 g，其中TW008果实中番茄红素含量最高（为46.79 mg/100 g），TW003果实中番茄红素含量最低（为24.72 mg/100 g），TW001、TW003、TW005、TW007、TW008、TW010、CK之间均差异显著，TW002与TW006之间差异不显著；番茄果实中抗坏血酸含量在13.35～31.72 mg/100 g，其中TW008果实中抗坏血酸含量最高，TW003果实中抗坏血酸含量最低，10个杂交子1代材料中除TW010外，其余材料之间均差异显著；番茄果实中可溶性糖含量在297.66～526.80 mg/100 g，其中TW002果实中可溶性糖含量最高，TW006果实中可溶性糖含量最低，这10个杂交子1代材料之间均差异显著；番茄果实中糖酸比在0.49～1.22，其中TW001果实中糖酸比最高， TW007果实中糖酸比最低，这10个杂交子1代材料之间均差异显著。根据隶属函数值可知，TW008得分最高，说明其番茄果实品质最好，TW001、TW002、TW004、TW005、TW007、TW008、TW009和TW010的数值均高于CK，因此，这8个材料均可在广西地区进行推广种植。
2.2 抗性鉴定分析
2.2.1 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1检测结果。Ty-1基因的双重SNP标记可检测出抗病纯合、抗病杂合、感病纯合材料，当纯合抗病材料经过PCR电泳过后，会出现1条965 bp的条带，杂合抗性材料会出现965 bp和1 343 bp 2条DNA带，而纯合感病材料会出现1条1 434 bp的条带。由图1可知，TW001、TW004、TW008和TW010为抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009为杂合材料，TW002、TW007为感病材料。
2.2.2 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2检测结果。含有黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2的材料可扩增出300 bp的条带，不含黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2的感病材料则扩增出600 bp的条带。由图2可知，所有的材料均为感病材料。
2.2.3 黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3检测结果。含有黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的材料可扩增出500 bp的条带，不含黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的材料可扩增出320 bp的条带。由图3可知，TW001、TW002、TW004、TW007、TW009为抗病杂合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010为感病纯合材料。
3 结论与讨论
（1）该试验结果表明，杂交子1代TW002和TW008的可滴定酸、可溶性糖、抗坏血酸含量均较高，其口味、风味、甜酸比、酸碱度等较优，更有益于贮藏，在加工、运输方面均有优势，与TW002相比，TW008的果实商品率更高、营养品质更好。与对照品种“艾比利”相比，10个杂交子1代中有8个得分高于“艾比利”，尤其是TW008，适合大面积推广。
（2）黄化曲叶病毒病抗性基因检测结果表明，Ty-1中TW001、TW004、TW008和TW010为抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009为杂合材料，TW002、TW007为感病材料；Ty-2中均为感病材料；Ty-3中TW001、TW002、TW004、TW007、TW009为抗病杂合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010为感病纯合材料。TW001、TW004为纯合体且抗Ty-1和Ty-3，可作为亲本材料；TW003、TW005、TW006、TW009均为杂合材料，需继续纯化；TW002、TW007材料经济性状一般，但感Ty-1、抗Ty-3。TW008感病但经济性状好，可作母本，TW010感病又无性状，应该淘汰。
参考文献
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