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【中图分类号】R284【文献标识码】A【文章编号】1550-1868（2014）10
【摘要】目的：应用HPLC法对不同产地不同采收期的仙鹤草药材中槲皮素含量进行分析比较。方法：采用HPLC法，色谱柱：Thermo BDS Hypersil-C18柱 （Part No： 28105-254630； 4.6 mm × 250 mm， 5 μm ） ，流动相为乙腈-甲醇-0.2%磷酸，检测波长为368nm，柱温30℃，流速1.0ml/min。结果：槲皮素在0.108～2.160μg（R2=0.9998）范围内呈良好线性关系；平均加样回收率为98.82% （RSD=0.81）；不同采收期的仙鹤草药材中槲皮素的含量差别较大，其中八月份采收的样品中槲皮素含量最高；不同产地的仙鹤草药材中槲皮素含量有明显差别，其中以浙江湖州产含量最高。 结论：仙鹤草药材采收时间的不同，其中的槲皮素成分会发生很大变化，八月份为仙鹤草药材的最佳采收期；不同产地仙鹤草中槲皮素含量差别很大，说明仙鹤草有效成分槲皮素受地域的影响很大；该方法精密度高、重复性好、稳定性好，能够准确测定仙鹤草中槲皮素成分的含量，结果表明不同产地的仙鹤草差别较大，为仙鹤草的质量控制提供依据。
【关键词】不同产地；仙鹤草；槲皮素；比较研究
Determination Comparison of Quercetin in Agrimoniae from Different Areas and Different Harvest Time
【Abstract】Objective： To analyze the determination of quercetin in agrimoniae from different place of produce by HPLC method. Method： HPLC conditions included Thermo BDS Hypersil-C18 column （Part No： 28105-254630； 4.6 mm × 250 mm， 5 μm） and the mobile phase was a mixture of acetonitrile， methanol and 0.2% phosphoric acid for gradient elution. The wavelength was 368nm and the column temperature was at 30℃. The flow rate was 1.0 ml/min. Results： Quercetin had good linear relationship in the range of 0.108～2.160μg （R2=0.9998）， its average recoveries was 98.82% （RSD=0.81%）； Contents of quercetin in agrimoniae from different areas and different harvest time were of much difference， while agrimoniae from Huzhou of Zhejiang and harvesting at August had higher content. Conclusion： Along with the change of harvesting time and places of produce， the contents of quercetin in agrimoniae were much different. The best harvest time was August and the better place for planting agrimoniae was Huzhou， Zhejiang Province. This method was steady with high precision and good repeatability. It could be used for the determination of quercetin and quality control of agrimoniaet.
【Keywords】different place of produce； agrimoniae； quercetin； analysis and comparison
仙鹤草Agrimonia Pilosa Leded是蔷薇科植物龙牙草Agri monia pilosa Ledeb的干燥地上部分， 主产于浙江、江苏、湖北、黑龙江等地， 此外， 安徽、福建、广东、河北、山东、辽宁等地亦产 [1]。为我国传统中药，其主要的化学成分为鞣质、间苯三酚衍生物、异香豆素、黄酮、三萜及三萜皂苷、有机酸等 [2， 3]。仙鹤草主要用于治疗衄血、咯血、尿血、便血、崩漏等各种出血症；现代药理学研究表明， 仙鹤草含有多种活性成分 [4]， 其具有较强的降血糖、抑菌和抗病毒等活性 [5-7]， 对体外培养的肿瘤细胞及实验动物移植性肿瘤均有抑制或杀伤作用， 还可提高荷瘤机体的免疫功能 [8， 9]。仙鹤草的质量控制未见报道， 确立仙鹤草药材的中槲皮素含量的测定方法， 有利于鉴别药材的真伪及制剂原料药材的质控。故实验选取了不同产地的仙鹤草药材， 建立了HPLC含量测定方法，测定8个不同产地的仙鹤草中槲皮素的含量，操作简便，方法可靠，可为药材的鉴别及质量控制提供参考依据。
1仪器与材料
Dionex Ultimate 3000 超高效液相色谱仪 （USA， Thermo Scientific）， 配備U-3000 Pump， U-3000 Auto Sampler， U-3000 RS Column Compartment and U-3000 Diode Array Detector； AG245电子分析天平 （瑞士， METTLER TOLEDO）；Centrifuge 5430R型高速离心机（USA， Eppendorf）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（中国，昆山）。 乙腈、甲醇均購自Scharlab S.L 公司（西班牙）；磷酸购于上海凌峰化学试剂有限公司（中国）；水为哇哈哈纯净水（哇哈哈公司，中国）。
槲皮素购于中国药品生物制品检验研究院，批号为：100081-201408，纯度>99%；仙鹤草8批分别产于浙江、江苏、安徽皖南、山东、云南曲靖、湖北、河北、黑龙江省牡丹江， 其中浙江产仙鹤草为八月初于湖州德清采集的药材并晒干备用，其余7批均为药材市场所售商品药材， 经浙江省食品药品检验研究中药室郭增喜老师鉴定为蔷薇科植物仙鹤草。
2方法和结果
2.1色谱条件
色谱柱：Thermo BDS Hypersil-C18柱 （Part No： 28105-254630； 4.6 mm × 250 mm， 5 μm ） ，流动相为乙腈-甲醇-0.2%磷酸，检测波长为368nm，柱温30℃，流速1.0ml/min。
2.2混合对照品溶液配制
精密称取槲皮素标准品适量，置50ml容量瓶中，用甲醇定容，摇均，配制成浓度为0.216mg/ml的对照品储备液。
2.3供试品溶液的制备
取干燥的仙鹤草药材（浙江湖州德清产），粉碎机粉碎后过三号筛，称取约10g，精密称定，用10倍量体积70%的乙醇回流提取2次， 每次2h， 合并提取液， 经减压浓缩得乙醇浸膏约1g， 加 20ml 水混悬， 20ml乙酸乙酯萃取两次，每次10min ，萃取液蒸干， 残渣加适量甲醇溶解并转移至5ml容量瓶中， 加甲醇稀释至刻度， 摇匀， 过0.45微孔滤膜，滤液即为供试品溶液。
2.4线性关系考查
分别精密吸取上述槲皮素标准品储备液0.5、1、2、5和10ml，用甲醇定容至10 ml， 摇匀， 0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，依次注入高效液相色谱仪10μl，按上述色谱条件进样分析，测定峰面积，以峰面积积分值为Y坐标，以进样量（μg）为X坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=5893X-4002，r=0.9998，线性范围为0.108～2.160μg；结果表明：槲皮素在线性范围内，其进样量值与峰面积积分值有良好的线性关系。
2.5精密度实验
精密吸取对照品溶液10μl，连续重复进样6次，测得槲皮素的峰面积积分值，并根据结果计算其相对标准偏差RSD为0.4 %，表明精密度良好。
2.6稳定性实验
取同一供试品溶液， 分别在0、3、6、9、15、36h进样， 测得对照品峰面积的RSD为1.1%， 表明供试品溶液在36h内稳定性良好。
2.7重复性实验
取同一批号供试品，按上述供试品溶液制备方法同法制备6份供试品溶液， 按上述色谱条件， 测得槲皮素对照品峰面积的RSD为1.3%。表明本试验方法重复性良好。
2.8加样回收率实验
取已知含量的同一批号仙鹤草样品，粉碎，取约5g，，精密称定，加入各对照品约60μg，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液制备方法操作，同法制备6份供试品溶液。按2.1项下色谱条件进行测定，并计算回收率。槲皮素对照品平均加样回收率为98.82%，RSD为0.81%，说明本法的回收率良好，符合方法学要求。
2.9样品含量测定
利用本试验建立的HPLC方法，测定8个不同产地的仙鹤草药材。以外标法计算样品中槲皮素的含量，结果如下表所示。
3讨论
3.1样品前处理方法的选择
在选择提取方法时，考察了提取溶剂（甲醇、50%甲醇、水）、提取方式 （超声、回流）以及提取时间对提取效率率的影响。结果表明，甲醇提取效率较高，回流提取方式提取效率更高，提取更加充分，回流2小时，重复2次，待测成分已完全提取溶出，因此，最终选择甲醇回流提取2小时为最优提取方案。
3.2色谱柱和柱温的选择
在选择色谱柱时，分别考察了Zorbax SB-C18、Eclipse-C18、Thermo BDS Hypersil-C18、Kromesil-C18、Extend-C18和SymmetryShield-RP18柱对峰形、保留时间的影响，同时还考察了柱温为在25、30和35℃时，四种色谱峰的分离效果。结果表明，Thermo BDS Hypersil-C18柱的分离效果最好，柱温30℃为佳。
3.3不同产地仙鹤草样品槲皮素含量比较
通过对不同产地共8批样品中槲皮素成分的含量测定结果分析，槲皮素的含量存在明显差异性，其中以浙江湖州产的含量较高，而以黑龙江牡丹市和云南曲靖产含量较低。说明仙鹤草药材的生长有较大的地域性。
3.4不同采收期仙鹤草样品槲皮素含量比较
通过对同一产地（浙江湖州）不同采收期（4～9 月）共5批仙鹤草样品中槲皮素成分的含量测定分析，结果显示，不同采收期的仙鹤草药材中槲皮素的含量也有显著不同。从4月至8月期间槲皮素的积累成上升趋势，8月份达到峰值，之后开始下降。不同采收期的仙鹤草药材中槲皮素的变化可以作为判定仙鹤草药材的有效成分槲皮素的积累情况，对仙鹤草药材的合理采收提供有效依据。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 （一部） [S]. 北京： 中国医药科技出版社， 2010： 94.
[2]潘娅， 刘红霞，庄玉磊，等.仙鹤草中黄酮类化学成分研究[J]. 中国中药杂志， 2010， 33 （24）： 2925-2928.
[3]李雅文， 黄兰芳， 梁晟， 等. 仙鹤草挥发油化学成分的气相色谱-质谱分[J]. 中南大学学报： 自然科学版， 2007， 38 （3）： 502-506.
[4]张东， 邬国栋， 张述禹. 仙鹤草的药理和临床研究新进展[J].中国药业， 2004， 13 （6）： 79-80.
[5]范尚坦，李金兰，杨忠东，等. 单味仙鹤草治疗糖尿病1例[J].福建中医药， 2002， 33 （2）： 2.
[6]范尚坦，李金兰，姚振华.仙鹤草降血糖的实验研究[J].医药导报，2004， 23 （10）： 710-711.
[7]陈优生.仙鹤草中降血糖活性成分提取方法比较研究[J].海峡药学， 2010， 22 （1）： 69-71.
[8]王力倩，余尚才，李仪奎，等.用血清药理学方法研究苦参仙鹤草的抗肿瘤作用.中国中医药科技 1995； 2 （5）： 19.
[9]王思功，李予蓉，王瑞宁，等.仙鹤草对人癌细胞裸鼠移植瘤的影响.第四军医大学学报1998； 19 （6）： 702.
【摘要】目的：应用HPLC法对不同产地不同采收期的仙鹤草药材中槲皮素含量进行分析比较。方法：采用HPLC法，色谱柱：Thermo BDS Hypersil-C18柱 （Part No： 28105-254630； 4.6 mm × 250 mm， 5 μm ） ，流动相为乙腈-甲醇-0.2%磷酸，检测波长为368nm，柱温30℃，流速1.0ml/min。结果：槲皮素在0.108～2.160μg（R2=0.9998）范围内呈良好线性关系；平均加样回收率为98.82% （RSD=0.81）；不同采收期的仙鹤草药材中槲皮素的含量差别较大，其中八月份采收的样品中槲皮素含量最高；不同产地的仙鹤草药材中槲皮素含量有明显差别，其中以浙江湖州产含量最高。 结论：仙鹤草药材采收时间的不同，其中的槲皮素成分会发生很大变化，八月份为仙鹤草药材的最佳采收期；不同产地仙鹤草中槲皮素含量差别很大，说明仙鹤草有效成分槲皮素受地域的影响很大；该方法精密度高、重复性好、稳定性好，能够准确测定仙鹤草中槲皮素成分的含量，结果表明不同产地的仙鹤草差别较大，为仙鹤草的质量控制提供依据。
【关键词】不同产地；仙鹤草；槲皮素；比较研究
Determination Comparison of Quercetin in Agrimoniae from Different Areas and Different Harvest Time
【Abstract】Objective： To analyze the determination of quercetin in agrimoniae from different place of produce by HPLC method. Method： HPLC conditions included Thermo BDS Hypersil-C18 column （Part No： 28105-254630； 4.6 mm × 250 mm， 5 μm） and the mobile phase was a mixture of acetonitrile， methanol and 0.2% phosphoric acid for gradient elution. The wavelength was 368nm and the column temperature was at 30℃. The flow rate was 1.0 ml/min. Results： Quercetin had good linear relationship in the range of 0.108～2.160μg （R2=0.9998）， its average recoveries was 98.82% （RSD=0.81%）； Contents of quercetin in agrimoniae from different areas and different harvest time were of much difference， while agrimoniae from Huzhou of Zhejiang and harvesting at August had higher content. Conclusion： Along with the change of harvesting time and places of produce， the contents of quercetin in agrimoniae were much different. The best harvest time was August and the better place for planting agrimoniae was Huzhou， Zhejiang Province. This method was steady with high precision and good repeatability. It could be used for the determination of quercetin and quality control of agrimoniaet.
【Keywords】different place of produce； agrimoniae； quercetin； analysis and comparison
仙鹤草Agrimonia Pilosa Leded是蔷薇科植物龙牙草Agri monia pilosa Ledeb的干燥地上部分， 主产于浙江、江苏、湖北、黑龙江等地， 此外， 安徽、福建、广东、河北、山东、辽宁等地亦产 [1]。为我国传统中药，其主要的化学成分为鞣质、间苯三酚衍生物、异香豆素、黄酮、三萜及三萜皂苷、有机酸等 [2， 3]。仙鹤草主要用于治疗衄血、咯血、尿血、便血、崩漏等各种出血症；现代药理学研究表明， 仙鹤草含有多种活性成分 [4]， 其具有较强的降血糖、抑菌和抗病毒等活性 [5-7]， 对体外培养的肿瘤细胞及实验动物移植性肿瘤均有抑制或杀伤作用， 还可提高荷瘤机体的免疫功能 [8， 9]。仙鹤草的质量控制未见报道， 确立仙鹤草药材的中槲皮素含量的测定方法， 有利于鉴别药材的真伪及制剂原料药材的质控。故实验选取了不同产地的仙鹤草药材， 建立了HPLC含量测定方法，测定8个不同产地的仙鹤草中槲皮素的含量，操作简便，方法可靠，可为药材的鉴别及质量控制提供参考依据。
1仪器与材料
Dionex Ultimate 3000 超高效液相色谱仪 （USA， Thermo Scientific）， 配備U-3000 Pump， U-3000 Auto Sampler， U-3000 RS Column Compartment and U-3000 Diode Array Detector； AG245电子分析天平 （瑞士， METTLER TOLEDO）；Centrifuge 5430R型高速离心机（USA， Eppendorf）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（中国，昆山）。 乙腈、甲醇均購自Scharlab S.L 公司（西班牙）；磷酸购于上海凌峰化学试剂有限公司（中国）；水为哇哈哈纯净水（哇哈哈公司，中国）。
槲皮素购于中国药品生物制品检验研究院，批号为：100081-201408，纯度>99%；仙鹤草8批分别产于浙江、江苏、安徽皖南、山东、云南曲靖、湖北、河北、黑龙江省牡丹江， 其中浙江产仙鹤草为八月初于湖州德清采集的药材并晒干备用，其余7批均为药材市场所售商品药材， 经浙江省食品药品检验研究中药室郭增喜老师鉴定为蔷薇科植物仙鹤草。
2方法和结果
2.1色谱条件
色谱柱：Thermo BDS Hypersil-C18柱 （Part No： 28105-254630； 4.6 mm × 250 mm， 5 μm ） ，流动相为乙腈-甲醇-0.2%磷酸，检测波长为368nm，柱温30℃，流速1.0ml/min。
2.2混合对照品溶液配制
精密称取槲皮素标准品适量，置50ml容量瓶中，用甲醇定容，摇均，配制成浓度为0.216mg/ml的对照品储备液。
2.3供试品溶液的制备
取干燥的仙鹤草药材（浙江湖州德清产），粉碎机粉碎后过三号筛，称取约10g，精密称定，用10倍量体积70%的乙醇回流提取2次， 每次2h， 合并提取液， 经减压浓缩得乙醇浸膏约1g， 加 20ml 水混悬， 20ml乙酸乙酯萃取两次，每次10min ，萃取液蒸干， 残渣加适量甲醇溶解并转移至5ml容量瓶中， 加甲醇稀释至刻度， 摇匀， 过0.45微孔滤膜，滤液即为供试品溶液。
2.4线性关系考查
分别精密吸取上述槲皮素标准品储备液0.5、1、2、5和10ml，用甲醇定容至10 ml， 摇匀， 0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，依次注入高效液相色谱仪10μl，按上述色谱条件进样分析，测定峰面积，以峰面积积分值为Y坐标，以进样量（μg）为X坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=5893X-4002，r=0.9998，线性范围为0.108～2.160μg；结果表明：槲皮素在线性范围内，其进样量值与峰面积积分值有良好的线性关系。
2.5精密度实验
精密吸取对照品溶液10μl，连续重复进样6次，测得槲皮素的峰面积积分值，并根据结果计算其相对标准偏差RSD为0.4 %，表明精密度良好。
2.6稳定性实验
取同一供试品溶液， 分别在0、3、6、9、15、36h进样， 测得对照品峰面积的RSD为1.1%， 表明供试品溶液在36h内稳定性良好。
2.7重复性实验
取同一批号供试品，按上述供试品溶液制备方法同法制备6份供试品溶液， 按上述色谱条件， 测得槲皮素对照品峰面积的RSD为1.3%。表明本试验方法重复性良好。
2.8加样回收率实验
取已知含量的同一批号仙鹤草样品，粉碎，取约5g，，精密称定，加入各对照品约60μg，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液制备方法操作，同法制备6份供试品溶液。按2.1项下色谱条件进行测定，并计算回收率。槲皮素对照品平均加样回收率为98.82%，RSD为0.81%，说明本法的回收率良好，符合方法学要求。
2.9样品含量测定
利用本试验建立的HPLC方法，测定8个不同产地的仙鹤草药材。以外标法计算样品中槲皮素的含量，结果如下表所示。
3讨论
3.1样品前处理方法的选择
在选择提取方法时，考察了提取溶剂（甲醇、50%甲醇、水）、提取方式 （超声、回流）以及提取时间对提取效率率的影响。结果表明，甲醇提取效率较高，回流提取方式提取效率更高，提取更加充分，回流2小时，重复2次，待测成分已完全提取溶出，因此，最终选择甲醇回流提取2小时为最优提取方案。
3.2色谱柱和柱温的选择
在选择色谱柱时，分别考察了Zorbax SB-C18、Eclipse-C18、Thermo BDS Hypersil-C18、Kromesil-C18、Extend-C18和SymmetryShield-RP18柱对峰形、保留时间的影响，同时还考察了柱温为在25、30和35℃时，四种色谱峰的分离效果。结果表明，Thermo BDS Hypersil-C18柱的分离效果最好，柱温30℃为佳。
3.3不同产地仙鹤草样品槲皮素含量比较
通过对不同产地共8批样品中槲皮素成分的含量测定结果分析，槲皮素的含量存在明显差异性，其中以浙江湖州产的含量较高，而以黑龙江牡丹市和云南曲靖产含量较低。说明仙鹤草药材的生长有较大的地域性。
3.4不同采收期仙鹤草样品槲皮素含量比较
通过对同一产地（浙江湖州）不同采收期（4～9 月）共5批仙鹤草样品中槲皮素成分的含量测定分析，结果显示，不同采收期的仙鹤草药材中槲皮素的含量也有显著不同。从4月至8月期间槲皮素的积累成上升趋势，8月份达到峰值，之后开始下降。不同采收期的仙鹤草药材中槲皮素的变化可以作为判定仙鹤草药材的有效成分槲皮素的积累情况，对仙鹤草药材的合理采收提供有效依据。
参考文献
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[6]范尚坦，李金兰，姚振华.仙鹤草降血糖的实验研究[J].医药导报，2004， 23 （10）： 710-711.
[7]陈优生.仙鹤草中降血糖活性成分提取方法比较研究[J].海峡药学， 2010， 22 （1）： 69-71.
[8]王力倩，余尚才，李仪奎，等.用血清药理学方法研究苦参仙鹤草的抗肿瘤作用.中国中医药科技 1995； 2 （5）： 19.
[9]王思功，李予蓉，王瑞宁，等.仙鹤草对人癌细胞裸鼠移植瘤的影响.第四军医大学学报1998； 19 （6）： 702.