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【摘 要】文章利用免疫胶体金的生物化学特性，吸附反应体系中的DNA，通过离心将其分离，并经过洗涤再离心，沉淀可直接用于PCR反应。实验结果表明：5μL和10μL免疫胶体金在室温下振荡孵育15 min对接触性DNA有足够的吸附能力。
【关键词】抗-DNA多克隆抗体;胶体金;接触性DNA
【中图分类号】D919.2 【文獻标识码】A 【文章编号】1674-0688（2018）12-0041-02
当前公安实战中，现勘人员提取到的接触类检材越来越多，而接触类检材样本中DNA含量很少，甚至存在大量PCR抑制剂，使得这类检材检出成功率很低。因此，我们需要探索一种能有效提高接触类检材检测成功率与准确性的方法。
胶体金是氯金酸（chLoroaurie acid，）在还原剂如抗坏血酸、白磷、鞣酸和枸橼酸钠等作用下，由于静电作用而成为一种稳定的胶体状态，聚合成带负电的疏水胶溶液。金颗粒为核，表面吸附和双层离子，能与蛋白质分子以及其他非共价生物大分子如酶、抗生素、多肽、激素、毒素等正电荷基团形成静电结合，且不影响其生物特性[1]。胶体金具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性，胶体金标记技术实质上就是蛋白质分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程，吸附机理是利用胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合[2]。在胶体金的制备过程中，所使用的玻璃容器需要绝对清洁，否则污染物会干扰胶体金的生成，产生凝集颗粒，还原剂的用量和强弱可以决定胶体金的大小，一般为5～150 nm，还原剂量越大，所制备的胶体金颗粒越小[3]。
本研究选用的是将抗-DNA多克隆抗体标记到直径为35 nm的胶体金颗粒上，制备而成免疫胶体金（immune coLLoidaL-goLd）。利用免疫胶体金的生物化学特性，吸附反应体系中的DNA，通过离心将其分离，并经过洗涤再离心，沉淀可直接用于PCR反应。
1 材料与方法
1.1 试剂及其来源
10 ng/uL DNA标准品：本实验室。抗-DNA多克隆抗体免疫胶体金冻干粉剂：北京博奥森生物技术有限公司。灭菌纯水：屈臣氏。PCR反应试剂：PowerPLex21试剂盒，Promega公司。电泳试剂：Hi-DiTM甲酰胺（AB公司）;PPLex21 ALLeLic Ladder（Promega公司）;CC5 ILS500（Promega公司）。
1.2 主要仪器
恒温混匀仪Thermomixer comfort：德国Eppendorf。5424小型台式离心机：德国Eppendorf公司。3130xL型遗传分析仪：美国AB公司。9700型PCR扩增仪：美国AB公司。
1.3 针对接触性DNA孵育条件的建立
（1）抗-DNA多克隆抗体免疫胶体金溶液的配置：取免疫胶体金冻干粉剂，加灭菌纯水溶解，配置成浓度为0.4 mg/mL的免疫胶体金溶液备用。
（2）模拟接触性DNA溶液的制备：提取DNA的标准品2 800 M（10 ng/μL）加入灭菌纯水制成终浓度为0.025 ng/μL DNA溶液备用。
（3）分组：将浓度为0.025 ng/μL DNA溶液按DNA的量分为A、B 2组，每组11个样本，进行3组平行试验，记录并编号。1号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液10μL，DNA的量为0.25 ng;2号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液20μL，DNA的量为0.5 ng;3号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液40μL，DNA的量为1.0 ng;4号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液60μL，DNA的量为1.5 ng;5号：取浓度0.025ng/μL DNA溶液80μL，DNA的量为2.0 ng;6号：取浓度0.025ng/μL DNA溶液100μL，DNA的量为2.5 ng;7号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液120μL，DNA的量为3.0 ng;8号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液140μL，DNA的量为3.5 ng;9号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液160μL，DNA的量为4.0 ng;10号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液180μL，DNA的量为4.5 ng;11号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液200μL，DNA的量为5.0 ng;
（4）分别往A组的各个样本里加入免疫胶体金5μL，分别往B组的各个样本里加入免疫胶体金10μL，振荡孵育15 min，13 000 r离心10min使免疫胶体金颗粒沉淀，吸取各样本离心后上清液，转移至另一0.5 mL管备检，留沉淀并取2.5μL沉淀，直接用于PCR反应。剩余沉淀存放于4 ℃冰箱用于复检。这样分组实验，保证了每种浓度留沉淀的样本在同一种实验方法下至少可以被独立验证6次，每种留上清液的样本在同一种实验方法下可以被独立验证3次，便于后续检测结果的统计与分析。
（5）PCR扩增及扩增产物检验：使用GeneAmp PCR System 9700型扩增仪（AB公司）和PowerPLex21试剂盒（Promega公司），PCR反应液（4×模板）;引物混合物（2×Primer，2×Mix）;去离子水（2×water）。进行30次循环。扩增程序为：96 ℃，1min，循环0次;94 ℃，10 s，59 ℃，1 min，72 ℃，30 s，30次循环;60 ℃，10 min，4 ℃，forever。其余操作过程按照试剂和仪器说明书进行。取PCR扩增产物2μL加入8μL甲酰胺和2μL ILS500（Promega公司）经热变性后，使用3130XL Genetic AnaLyzer（ABI公司）进行毛细管电泳，用Genemapper软件进行分析，得出等位基因分型。
2 实验结果
（1）分别加入5μL胶体金，孵育15 min后离心，沉淀及上清液检测实验结果见表1（“+”代表检出，“-”代表未检出）。
（2）分别加入10μL胶体金，孵育15 min后离心，沉淀及上清液检测实验结果见表2（“+”代表检出，“-”代表未检出）。
3 结论
实验结果表明：200μL体系加入5μL免疫胶体金室温下振荡孵育15 min对接触性DNA有足够的吸附能力，可获得相对较好的PCR扩增结果，本研究建立了应用免疫胶体金技术提取接触性DNA的孵育条件，为后续运用抗-DNA多克隆抗体免疫胶体金，与DNA特异性结合，用于不同类接触性检材DNA提取的研究奠定了基础。
参 考 文 献
[1]康熙雄.免疫胶体金技术临床应用[M].北京：军事医学科学出版社，2010.
[2]许欣，王锋，等.免疫胶体金技术及其在临床诊断上的研究进展[J].江西农业学报，2009，21（6）.
[3]朱文钏，孔繁德，林祥梅，等.免疫胶体金技术的应用及展望[J].生物技术学报，2010（4）.
【关键词】抗-DNA多克隆抗体;胶体金;接触性DNA
【中图分类号】D919.2 【文獻标识码】A 【文章编号】1674-0688（2018）12-0041-02
当前公安实战中，现勘人员提取到的接触类检材越来越多，而接触类检材样本中DNA含量很少，甚至存在大量PCR抑制剂，使得这类检材检出成功率很低。因此，我们需要探索一种能有效提高接触类检材检测成功率与准确性的方法。
胶体金是氯金酸（chLoroaurie acid，）在还原剂如抗坏血酸、白磷、鞣酸和枸橼酸钠等作用下，由于静电作用而成为一种稳定的胶体状态，聚合成带负电的疏水胶溶液。金颗粒为核，表面吸附和双层离子，能与蛋白质分子以及其他非共价生物大分子如酶、抗生素、多肽、激素、毒素等正电荷基团形成静电结合，且不影响其生物特性[1]。胶体金具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性，胶体金标记技术实质上就是蛋白质分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程，吸附机理是利用胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合[2]。在胶体金的制备过程中，所使用的玻璃容器需要绝对清洁，否则污染物会干扰胶体金的生成，产生凝集颗粒，还原剂的用量和强弱可以决定胶体金的大小，一般为5～150 nm，还原剂量越大，所制备的胶体金颗粒越小[3]。
本研究选用的是将抗-DNA多克隆抗体标记到直径为35 nm的胶体金颗粒上，制备而成免疫胶体金（immune coLLoidaL-goLd）。利用免疫胶体金的生物化学特性，吸附反应体系中的DNA，通过离心将其分离，并经过洗涤再离心，沉淀可直接用于PCR反应。
1 材料与方法
1.1 试剂及其来源
10 ng/uL DNA标准品：本实验室。抗-DNA多克隆抗体免疫胶体金冻干粉剂：北京博奥森生物技术有限公司。灭菌纯水：屈臣氏。PCR反应试剂：PowerPLex21试剂盒，Promega公司。电泳试剂：Hi-DiTM甲酰胺（AB公司）;PPLex21 ALLeLic Ladder（Promega公司）;CC5 ILS500（Promega公司）。
1.2 主要仪器
恒温混匀仪Thermomixer comfort：德国Eppendorf。5424小型台式离心机：德国Eppendorf公司。3130xL型遗传分析仪：美国AB公司。9700型PCR扩增仪：美国AB公司。
1.3 针对接触性DNA孵育条件的建立
（1）抗-DNA多克隆抗体免疫胶体金溶液的配置：取免疫胶体金冻干粉剂，加灭菌纯水溶解，配置成浓度为0.4 mg/mL的免疫胶体金溶液备用。
（2）模拟接触性DNA溶液的制备：提取DNA的标准品2 800 M（10 ng/μL）加入灭菌纯水制成终浓度为0.025 ng/μL DNA溶液备用。
（3）分组：将浓度为0.025 ng/μL DNA溶液按DNA的量分为A、B 2组，每组11个样本，进行3组平行试验，记录并编号。1号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液10μL，DNA的量为0.25 ng;2号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液20μL，DNA的量为0.5 ng;3号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液40μL，DNA的量为1.0 ng;4号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液60μL，DNA的量为1.5 ng;5号：取浓度0.025ng/μL DNA溶液80μL，DNA的量为2.0 ng;6号：取浓度0.025ng/μL DNA溶液100μL，DNA的量为2.5 ng;7号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液120μL，DNA的量为3.0 ng;8号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液140μL，DNA的量为3.5 ng;9号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液160μL，DNA的量为4.0 ng;10号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液180μL，DNA的量为4.5 ng;11号：取浓度0.025 ng/μL DNA溶液200μL，DNA的量为5.0 ng;
（4）分别往A组的各个样本里加入免疫胶体金5μL，分别往B组的各个样本里加入免疫胶体金10μL，振荡孵育15 min，13 000 r离心10min使免疫胶体金颗粒沉淀，吸取各样本离心后上清液，转移至另一0.5 mL管备检，留沉淀并取2.5μL沉淀，直接用于PCR反应。剩余沉淀存放于4 ℃冰箱用于复检。这样分组实验，保证了每种浓度留沉淀的样本在同一种实验方法下至少可以被独立验证6次，每种留上清液的样本在同一种实验方法下可以被独立验证3次，便于后续检测结果的统计与分析。
（5）PCR扩增及扩增产物检验：使用GeneAmp PCR System 9700型扩增仪（AB公司）和PowerPLex21试剂盒（Promega公司），PCR反应液（4×模板）;引物混合物（2×Primer，2×Mix）;去离子水（2×water）。进行30次循环。扩增程序为：96 ℃，1min，循环0次;94 ℃，10 s，59 ℃，1 min，72 ℃，30 s，30次循环;60 ℃，10 min，4 ℃，forever。其余操作过程按照试剂和仪器说明书进行。取PCR扩增产物2μL加入8μL甲酰胺和2μL ILS500（Promega公司）经热变性后，使用3130XL Genetic AnaLyzer（ABI公司）进行毛细管电泳，用Genemapper软件进行分析，得出等位基因分型。
2 实验结果
（1）分别加入5μL胶体金，孵育15 min后离心，沉淀及上清液检测实验结果见表1（“+”代表检出，“-”代表未检出）。
（2）分别加入10μL胶体金，孵育15 min后离心，沉淀及上清液检测实验结果见表2（“+”代表检出，“-”代表未检出）。
3 结论
实验结果表明：200μL体系加入5μL免疫胶体金室温下振荡孵育15 min对接触性DNA有足够的吸附能力，可获得相对较好的PCR扩增结果，本研究建立了应用免疫胶体金技术提取接触性DNA的孵育条件，为后续运用抗-DNA多克隆抗体免疫胶体金，与DNA特异性结合，用于不同类接触性检材DNA提取的研究奠定了基础。
参 考 文 献
[1]康熙雄.免疫胶体金技术临床应用[M].北京：军事医学科学出版社，2010.
[2]许欣，王锋，等.免疫胶体金技术及其在临床诊断上的研究进展[J].江西农业学报，2009，21（6）.
[3]朱文钏，孔繁德，林祥梅，等.免疫胶体金技术的应用及展望[J].生物技术学报，2010（4）.