为了建立一种分子标记辅助育种技术体系，增加羊肚菌单孢杂交育种成功机率，本研究以梯棱羊肚菌(F0)为供试亲本，通过单孢分离和交配型基因鉴定获得100个单孢子，从中筛选出20个培养性状良好的单交配型杂交亲本，其中MAT1-1交配型和MAT1-2交配型各10个。利用不同交配型单孢菌株两两杂交获得100个杂交组合并进行出菇实验。对子囊果的农艺性状、产量进行测定，并对杂交菌株交配型基因进行验证，于第二年再次进行单孢杂交及杂交菌株子代栽培试验。结果表明，F1代羊肚菌优质高产组合为TLD32×9、TLD22×15、TLD2×9，最高产量达到了216kg/667m2，远高于亲本梯棱羊肚菌的180kg/667m2，F2代羊肚菌高产稳产菌株为TLD22×15，最高产量达到了266kg/667m2，且子囊果菌盖大，菌柄小，不易碎，商品性状良好。本研究建立的以交配型基因为基础选育羊肚菌杂交新品种的高效杂交育种技术体系，有助于促进羊肚菌优良品种选育并为其杂交育种提供理论依据。