【摘 要】
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目的构建STAT3荧光素酶报告基因检测系统并检测STAT3活化能力,为筛选STAT3活性调控相关药物提供实验基础。方法基因合成STAT3反应元件序列,退火形成含酶切位点的双链DNA,内切
【机 构】
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西安交通大学第一附属医院转化医学中心,陕西省肿瘤精准医学重点实验室,西安交通大学第一附属医院消化内科,西安交通大学第一附属医院骨科,西安交通大学第一附属医院皮肤科,西安交通大学第一附属医院检验科,西安
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目(81201373;81703130);陕西省社会发展科技攻关项目(2016SF-238);西安交通大学第一附属医院院基金资助项目(2016QN-13)
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目的构建STAT3荧光素酶报告基因检测系统并检测STAT3活化能力,为筛选STAT3活性调控相关药物提供实验基础。方法基因合成STAT3反应元件序列,退火形成含酶切位点的双链DNA,内切酶XhoⅠ和HindⅢ双酶切报告基因载体p GL6-TA,T4 DNA连接酶将STAT3反应元件插入p GL6-TA载体多克隆位点,将该载体转染He La细胞,G418筛选STAT3荧光素酶报告基因稳定表达的单克隆He La细胞株。5,10,20 ng/ml不同浓度激动剂IL-6和20,40,80μmol/L抑制剂S3I-201刺激单克隆He La-STAT3-Luc细胞,检测荧光素酶对应的发光值验证STAT3荧光素酶报告基因检测系统的检测能力。结果测序和比对结果显示,STAT3荧光素酶报告基因系统p GL6-STAT3-Luc中STAT3反应元件序列正确;G418成功筛选出稳定表达STAT3荧光素酶报告基因的单克隆He La细胞株;5,10和20 ng/ml浓度IL-6可刺激He La-STAT3-Luc细胞中荧光素酶的活性显著升高(P<0.001),且分别升高5.4,10.3和20.0倍;不同时间点检测1 ng/ml和5 ng/ml浓度IL-6刺激He La-STAT3-Luc细胞,其荧光素酶的活性呈现线性增长趋势;40μmol/L和80μmol/L浓度的抑制剂S3I-201与10 ng/ml浓度IL-6共刺激He La-STAT3-Luc细胞,其荧光素酶的活性显著降低(P<0.001),STAT3活化的抑制率分别为18.9%和43.7%。结论成功构建STAT3荧光素酶报告基因检测系统,该系统具有有效检测STAT3活化水平的能力。
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