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摘要 [目的]比较霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛的叶表皮微形态结构特征，为霍山石斛的真伪鉴定提供依据。 [方法]在光学显微镜下，觀察霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛的叶表皮微形态结构，并测定气孔器密度、分布及气孔指数等。[结果]3种石斛叶的上表皮细胞多为规则的六边形，霍山石斛野生植株、组培植株下表皮细胞为不规则形和近多边形，河南石斛的下表皮细胞为多边形，3种植物垂周壁式样相似；3种石斛叶的上表皮均无气孔，下表皮气孔无规则分布，霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛气孔长宽比分别为1.12、1.55、1.31，气孔器密度分别为109、156、94个/mm2，气孔指数分别为8.9%、12.5%、8.2%。 [结论]霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛叶表皮细胞形状、气孔分布、垂周壁式样均比较相似，难以作为分类的依据。气孔器形状、密度、大小表现出比较稳定的差异，可以作为这3种石斛之间区分的依据。
关键词 霍山石斛野生植株；霍山石斛组培植株；河南石斛；微形态特征；气孔器密度；气孔指数
中图分类号 S567.23文献标识码
A文章编号 0517-6611（2016）25-186-03
Micromorphological Characters of Leaf Epidermis of Wild and Tissuecultured Dendrobium huoshanense Tang et Cheng and Dendrobium henanense
CHEN Naidong1，2，3，LI Jun3*
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，West Anhui University，Lu’an，Anhui 237012； 2.West Anhui Biotechnology Research Center of Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine，West Anhui University，Lu’an，Anhui 237012； 3.School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032）
Abstract [Objective] To compare the micromorphological characters of leaf epidermis of wild and tissuecultured Dendrobium huoshanense Tang et Cheng and Dendrobium henanense，and to provide references for the identification of D.huoshanense.[Method] Under optical microscope，leaf epidermis of wild and tissuecultured D.huoshanense as well as D.henanense were observed and researched，and the corresponding quantitative index were detected.[Result] The upper epidermal cell shapes of the three Dendrobium samples were mostly regular hexagon，the lower epidermal cells were irregular for wild and tissuecultured D.huoshanensewhile polygonal for D.henanense.Anticlinal walls of upper and lower epidermis were almost straight； All the three plants had stomata apparatuses in lower epidermis with irregular arrangement，which showed 1.12， 155，1.31 length to width ratio，109，156，94/mm2 stomata density，8.9%，12.5%，8.2% stomata index of wild D.huoshanense，tissuecultured D.huoshanense and D.henanense，respectively.[Conclusion] Relatively stable differences were showed in the shape，size and density of the stomata apparatus in the leaf epidermis of wild D.huoshanense，tissuecultured D.huoshanense and D.henanense，which could be used as the basis for the discrimination of the three plants.The shapes of leaf epidermis cells and distribution of stomata apparatus are quite similar and thus can’t be used to discriminate the three investigated Dendrobium samples.
Key words Wild Dendrobium huoshanense； Tissuecultured Dendrobium huoshanense； Dendrobium henanense； Micro morphology characters； Stomatal density； Stomatal index 霍山石斛（Dendrobium huoshannese Tang et Cheng）属兰科石斛属多年生草本植物[1]，主产于安徽霍山、岳西、潜山等地，含多糖、生物碱及丰富的微量元素[2-7]，具有生津益胃、抗肿瘤、抗白内障等多种功效[2]，是安徽道地药材之一。由于霍山石斛自然状态下萌芽率低、生长缓慢，加上长期过度采挖，其野生资源已濒临灭绝[8-9]，市价高达30万～40万元/kg。在霍山石斛的道地产区，采用组培快繁快速获得试管苗或人工诱导种子萌发产生实生苗大规模野外栽培的组培霍山石斛，已逐渐替代野生资源成为药用霍山石斛的主要来源[2，4，6-7]。近期的研究热点主要集中在霍山石斛药用有效成分分析、引种驯化、人工种植、组织培养等方面[2，4，6-7]，对其品种鉴定鲜有报道。当前市场上霍山石斛伪品很多，亟需构建一套方法用于霍山石斛药材鉴定。
植物的叶表皮微形态特征具有较高的遗传稳定性，含有丰富的分类信息，可用于植物种间或属间分类及其系统关系探讨[10-13]，且只需要少量的植物叶片便可开展研究。霍山石斛组培植株、野生植株二者具有相同的遗传信息和高度相似的形态学特征，但由于种源不同（组培植株来自与试管苗野外驯化栽培，而野生植株来自自然状态下种子繁殖生长），二者的药效物质基础存在明显差异[3-6]。作为霍山石斛的近缘种——河南石斛（Dendrobium henanense J.L.Lu et L.X Gao），与霍山石斛具有极为相似的形态和不同的次生代谢产物组成，在石斛市场上为霍山石斛的主要伪品，因此，研究不同种源的霍山石斛与河南石斛微形态特征差别，构建霍山石斛快速鉴定方法，对霍山石斛产业的发展具有重要意义。目前对霍山石斛、河南石斛叶表皮微形态特征的研究尚未见报道。该试验拟对霍山石斛的野生、组培植株及河南石斛叶表皮微形态特征进行初步研究，为霍山石斛的真伪鉴定提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试材 试验材料于2014年10月采自安徽省霍山县太平畈鄉，品种经安徽省省级2011协同创新中心——霍山石斛产业化开发协同创新中心主任陈乃富教授鉴定为组培霍山石斛（tissuecultured Dendrobium huoshanense）、野生霍山石斛（wild Dendrobium huoshanense）、河南石斛（Dendrobium henanense）。
1.2 仪器和试剂 光学显微镜（BM200，南京江南永新光学有限公司）。次氯酸钠（国药集团化学试剂有限公司）、番红（AR，国药集团化学试剂有限公司）、无水乙醇（AR，上海振兴化工一厂）、二甲苯（AR，广东翁江化学试剂有限公司）、中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 叶表皮装片的制备。取完整成熟叶片剪取中部中脉两侧约5 mm×5 mm的小块，用水煮沸5～10 min后置于30%NaClO溶液中浸泡至颜色发白后取出，用蒸馏水反复清洗后轻轻剥离叶片的上下表皮，转移到一块滴有蒸馏水的洁净载玻片上，将叶表皮展开，除去水分，滴加1%番红溶液染色30.0 min。35%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇梯度脱水，二甲苯∶乙醇（1∶1）溶液透明处理后中性树胶封片[14-15]。显微镜观察、拍照、测量。
1.3.2 指标统计。
1.3.2.1 气孔大小及长宽比。取叶表皮封片置于光学显微镜下，随机测 30个气孔大小、长宽比，求它们的平均值。
1.3.2.2 气孔分布特征。将叶表皮封片置于光学显微镜下，观察气孔分布特点。
1.3.2.3 气孔密度。
取叶表皮封片置于光学显微镜下，观察单位面积内气孔个数，计算气孔密度，其计算公式为D=S/M，式中，S为固定面积内气孔数目，M为固定面积。
1.3.2.4 气孔指数。
取叶表皮封片置于光学显微镜下，随机观察5个视野，统计单位视野气孔数（S）和单位视野普通表皮细胞数（P），根据公式I=S/（S+P）×100%计算气孔指数（I）。
2 结果与分析
由图1可见，霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛叶下表皮气孔无规则分布，叶片上表皮均无气孔。霍山石斛组培植株与河南石斛叶表皮气孔纵轴多与叶脉平行，霍山石斛野生植株叶表皮气孔纵轴部分与叶脉平行；霍山石斛野生植株气孔近圆形（长宽比为1.12）、组培植株气孔器为长椭圆形（长宽比为1.55），河南石斛气孔为宽椭圆形（长宽比为1.31）。3种石斛样品气孔器长度从大到小依次为河南石斛、霍山石斛组培植株、霍山石斛野生植株（表1），霍山石斛组培植株和野生植株在细胞器微形态特征的差异说明种源对霍山石斛叶表皮微形态特征可能产生一定的影响，市场上霍山石斛主要伪品——河南石斛与霍山石斛气孔器形状差异可为霍山石斛真伪鉴定提供参考依据[15]；霍山石斛野生植株与河南石斛的气孔器密度和气孔指数较为接近，但明显低于霍山石斛组培植株（表1），与霍山石斛组培植株生长速度显著高于霍山石斛野生植株与河南石斛相一致，可用于霍山石斛组培植株和野生植株鉴定的辅助依据。
从表2可看出，霍山石斛野生、组培植株下表皮细胞形状相似，均为不规则、近多边形，河南石斛的下表皮细胞为多边形； 3种石斛的上表皮细胞形状相似，均为多边形，且多为规则的六边形，上表皮细胞略大于下表皮细胞；霍山石斛野生植株和组培植株下表皮垂周壁式样均为近平直、弧形，上表皮垂周壁式样为近平直、较厚，河南石斛的上、下表皮垂周壁式样均为近平直、平直。
3 结论
该研究利用光学显微镜观察霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛的叶表皮微形态结构，并测定其气孔器密度、分布及气孔指数等，比较霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛的叶表皮微形态结构特征。结果表明，3种石斛叶的上表皮细胞形多为规则的六边形，霍山石斛野生植株、组培植株下表皮细胞为不规则形和近多边形，河南石斛的下表皮细胞为多边形；3种植物垂周壁式样相似；3种石斛叶的上表皮均无气孔，下表皮气孔无规则分布，霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛气孔长宽比分别为1.12、1.55、1.31，气孔器密度分别为109、156、94个/mm2，气孔指数分别为8.9%、12.5%、8.2%。可见，霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛叶表皮细胞形状、气孔分布、垂周壁式样均比较相似，难以作为分类的依据。气孔器形状、密度、大小表现出比较稳定的差异，可以作为这3种石斛之间区分的依据。 参考文献
[1]
包雪声，顺庆生，陈立钻.中国药用石斛[M].上海：上海医科大学出版社，2001：75.
[2] 陈乃东，程艳，陈乃富，等.霍山石斛·河南石斛金属元素含量比较研究[J].安徽农业科学，2015，43（18）：316-317.
[3] 陈乃东，李俊，金晖，等.HPLC-UV-CL联用研究霍山石斛生物碱清除自由基活性[J].食品工业科技，2015，36（7）：276-280.
[4] 陈乃东，高峰，林欣，等.不同种源霍山石斛生物碱比较研究[J].中药材，2014，37（6）：953-956.
[5] CHEN N D，CHEN N F，LI J，et al.Rapid authentication of different ages of tissue-cultured and wild Dendrobium huoshanense as well as wild Dendrobium henanense using FTIR and 2DCOS IR[J].Journal of molecular structure，2015，1101：101-108.
[6] CHEN N D，CHEN H，LI J，et al.Discrimination and similarity evaluation of tissuecultured and wild Dendrobium species using Fourier transform infrared spectroscopy[J].Journal of molecular structure，2015，1086（4）：255-265.
[7] 陳乃东，孟云飞，姚厚军，等.柱前衍生化HPCE法测定不同种源石斛中多糖的单糖组成[J].中药材，2015，38（8）：1608-1611.
[8] 吴胡琦，罗建平.霍山石斛的研究进展[J].时珍国医国药，2010，21（1）：208-211.
[9] 张炜玲，王新生，戴亚峰，等.霍山石斛最新研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（36）：20661-20663，20719.
[10] 李兆孟，周勇辉，刘玉萍，等.基于形态和叶表皮微形态特征试论国产赖草属属下类群间的系统关系[J].植物研究，2016，36（1）：10-25.
[11] 雒宏佳，刘亚斌，常朝阳.29种中国野豌豆属植物叶表皮微形态特征及其系统学意义[J].西北植物学报，2015，35（1）：76-88.
[12] 张健，闻志彬，张明理.中国木蓼属植物叶表皮微形态特征及其分类学意义[J].植物资源与环境学报，2013，22（2）：8-17.
[13] 郭莉娟，王志华，李捷.美洲鳄梨属植物的叶表皮微形态特征及其分类学意义[J].云南植物研究，2010，32（3）：189-203.
[14] 陈乃东.胡枝子属植物叶表皮微形态特征及春花胡枝子黄酮类化合物的研究[D].芜湖：安徽师范大学，2007：25-46.
[15] 张明宇，虞泓，邓成西，等.石斛属植物叶表皮特征及其分类学意义[J].西南农业学报，2007，20（4）：716-720.
关键词 霍山石斛野生植株；霍山石斛组培植株；河南石斛；微形态特征；气孔器密度；气孔指数
中图分类号 S567.23文献标识码
A文章编号 0517-6611（2016）25-186-03
Micromorphological Characters of Leaf Epidermis of Wild and Tissuecultured Dendrobium huoshanense Tang et Cheng and Dendrobium henanense
CHEN Naidong1，2，3，LI Jun3*
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，West Anhui University，Lu’an，Anhui 237012； 2.West Anhui Biotechnology Research Center of Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine，West Anhui University，Lu’an，Anhui 237012； 3.School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032）
Abstract [Objective] To compare the micromorphological characters of leaf epidermis of wild and tissuecultured Dendrobium huoshanense Tang et Cheng and Dendrobium henanense，and to provide references for the identification of D.huoshanense.[Method] Under optical microscope，leaf epidermis of wild and tissuecultured D.huoshanense as well as D.henanense were observed and researched，and the corresponding quantitative index were detected.[Result] The upper epidermal cell shapes of the three Dendrobium samples were mostly regular hexagon，the lower epidermal cells were irregular for wild and tissuecultured D.huoshanensewhile polygonal for D.henanense.Anticlinal walls of upper and lower epidermis were almost straight； All the three plants had stomata apparatuses in lower epidermis with irregular arrangement，which showed 1.12， 155，1.31 length to width ratio，109，156，94/mm2 stomata density，8.9%，12.5%，8.2% stomata index of wild D.huoshanense，tissuecultured D.huoshanense and D.henanense，respectively.[Conclusion] Relatively stable differences were showed in the shape，size and density of the stomata apparatus in the leaf epidermis of wild D.huoshanense，tissuecultured D.huoshanense and D.henanense，which could be used as the basis for the discrimination of the three plants.The shapes of leaf epidermis cells and distribution of stomata apparatus are quite similar and thus can’t be used to discriminate the three investigated Dendrobium samples.
Key words Wild Dendrobium huoshanense； Tissuecultured Dendrobium huoshanense； Dendrobium henanense； Micro morphology characters； Stomatal density； Stomatal index 霍山石斛（Dendrobium huoshannese Tang et Cheng）属兰科石斛属多年生草本植物[1]，主产于安徽霍山、岳西、潜山等地，含多糖、生物碱及丰富的微量元素[2-7]，具有生津益胃、抗肿瘤、抗白内障等多种功效[2]，是安徽道地药材之一。由于霍山石斛自然状态下萌芽率低、生长缓慢，加上长期过度采挖，其野生资源已濒临灭绝[8-9]，市价高达30万～40万元/kg。在霍山石斛的道地产区，采用组培快繁快速获得试管苗或人工诱导种子萌发产生实生苗大规模野外栽培的组培霍山石斛，已逐渐替代野生资源成为药用霍山石斛的主要来源[2，4，6-7]。近期的研究热点主要集中在霍山石斛药用有效成分分析、引种驯化、人工种植、组织培养等方面[2，4，6-7]，对其品种鉴定鲜有报道。当前市场上霍山石斛伪品很多，亟需构建一套方法用于霍山石斛药材鉴定。
植物的叶表皮微形态特征具有较高的遗传稳定性，含有丰富的分类信息，可用于植物种间或属间分类及其系统关系探讨[10-13]，且只需要少量的植物叶片便可开展研究。霍山石斛组培植株、野生植株二者具有相同的遗传信息和高度相似的形态学特征，但由于种源不同（组培植株来自与试管苗野外驯化栽培，而野生植株来自自然状态下种子繁殖生长），二者的药效物质基础存在明显差异[3-6]。作为霍山石斛的近缘种——河南石斛（Dendrobium henanense J.L.Lu et L.X Gao），与霍山石斛具有极为相似的形态和不同的次生代谢产物组成，在石斛市场上为霍山石斛的主要伪品，因此，研究不同种源的霍山石斛与河南石斛微形态特征差别，构建霍山石斛快速鉴定方法，对霍山石斛产业的发展具有重要意义。目前对霍山石斛、河南石斛叶表皮微形态特征的研究尚未见报道。该试验拟对霍山石斛的野生、组培植株及河南石斛叶表皮微形态特征进行初步研究，为霍山石斛的真伪鉴定提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试材 试验材料于2014年10月采自安徽省霍山县太平畈鄉，品种经安徽省省级2011协同创新中心——霍山石斛产业化开发协同创新中心主任陈乃富教授鉴定为组培霍山石斛（tissuecultured Dendrobium huoshanense）、野生霍山石斛（wild Dendrobium huoshanense）、河南石斛（Dendrobium henanense）。
1.2 仪器和试剂 光学显微镜（BM200，南京江南永新光学有限公司）。次氯酸钠（国药集团化学试剂有限公司）、番红（AR，国药集团化学试剂有限公司）、无水乙醇（AR，上海振兴化工一厂）、二甲苯（AR，广东翁江化学试剂有限公司）、中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 叶表皮装片的制备。取完整成熟叶片剪取中部中脉两侧约5 mm×5 mm的小块，用水煮沸5～10 min后置于30%NaClO溶液中浸泡至颜色发白后取出，用蒸馏水反复清洗后轻轻剥离叶片的上下表皮，转移到一块滴有蒸馏水的洁净载玻片上，将叶表皮展开，除去水分，滴加1%番红溶液染色30.0 min。35%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇梯度脱水，二甲苯∶乙醇（1∶1）溶液透明处理后中性树胶封片[14-15]。显微镜观察、拍照、测量。
1.3.2 指标统计。
1.3.2.1 气孔大小及长宽比。取叶表皮封片置于光学显微镜下，随机测 30个气孔大小、长宽比，求它们的平均值。
1.3.2.2 气孔分布特征。将叶表皮封片置于光学显微镜下，观察气孔分布特点。
1.3.2.3 气孔密度。
取叶表皮封片置于光学显微镜下，观察单位面积内气孔个数，计算气孔密度，其计算公式为D=S/M，式中，S为固定面积内气孔数目，M为固定面积。
1.3.2.4 气孔指数。
取叶表皮封片置于光学显微镜下，随机观察5个视野，统计单位视野气孔数（S）和单位视野普通表皮细胞数（P），根据公式I=S/（S+P）×100%计算气孔指数（I）。
2 结果与分析
由图1可见，霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛叶下表皮气孔无规则分布，叶片上表皮均无气孔。霍山石斛组培植株与河南石斛叶表皮气孔纵轴多与叶脉平行，霍山石斛野生植株叶表皮气孔纵轴部分与叶脉平行；霍山石斛野生植株气孔近圆形（长宽比为1.12）、组培植株气孔器为长椭圆形（长宽比为1.55），河南石斛气孔为宽椭圆形（长宽比为1.31）。3种石斛样品气孔器长度从大到小依次为河南石斛、霍山石斛组培植株、霍山石斛野生植株（表1），霍山石斛组培植株和野生植株在细胞器微形态特征的差异说明种源对霍山石斛叶表皮微形态特征可能产生一定的影响，市场上霍山石斛主要伪品——河南石斛与霍山石斛气孔器形状差异可为霍山石斛真伪鉴定提供参考依据[15]；霍山石斛野生植株与河南石斛的气孔器密度和气孔指数较为接近，但明显低于霍山石斛组培植株（表1），与霍山石斛组培植株生长速度显著高于霍山石斛野生植株与河南石斛相一致，可用于霍山石斛组培植株和野生植株鉴定的辅助依据。
从表2可看出，霍山石斛野生、组培植株下表皮细胞形状相似，均为不规则、近多边形，河南石斛的下表皮细胞为多边形； 3种石斛的上表皮细胞形状相似，均为多边形，且多为规则的六边形，上表皮细胞略大于下表皮细胞；霍山石斛野生植株和组培植株下表皮垂周壁式样均为近平直、弧形，上表皮垂周壁式样为近平直、较厚，河南石斛的上、下表皮垂周壁式样均为近平直、平直。
3 结论
该研究利用光学显微镜观察霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛的叶表皮微形态结构，并测定其气孔器密度、分布及气孔指数等，比较霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛的叶表皮微形态结构特征。结果表明，3种石斛叶的上表皮细胞形多为规则的六边形，霍山石斛野生植株、组培植株下表皮细胞为不规则形和近多边形，河南石斛的下表皮细胞为多边形；3种植物垂周壁式样相似；3种石斛叶的上表皮均无气孔，下表皮气孔无规则分布，霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛气孔长宽比分别为1.12、1.55、1.31，气孔器密度分别为109、156、94个/mm2，气孔指数分别为8.9%、12.5%、8.2%。可见，霍山石斛野生植株、组培植株与河南石斛叶表皮细胞形状、气孔分布、垂周壁式样均比较相似，难以作为分类的依据。气孔器形状、密度、大小表现出比较稳定的差异，可以作为这3种石斛之间区分的依据。 参考文献
[1]
包雪声，顺庆生，陈立钻.中国药用石斛[M].上海：上海医科大学出版社，2001：75.
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[10] 李兆孟，周勇辉，刘玉萍，等.基于形态和叶表皮微形态特征试论国产赖草属属下类群间的系统关系[J].植物研究，2016，36（1）：10-25.
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[14] 陈乃东.胡枝子属植物叶表皮微形态特征及春花胡枝子黄酮类化合物的研究[D].芜湖：安徽师范大学，2007：25-46.
[15] 张明宇，虞泓，邓成西，等.石斛属植物叶表皮特征及其分类学意义[J].西南农业学报，2007，20（4）：716-720.